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RNA 提取及PT-PCR技术;
;mRNA;实验安排;实验一 小鼠总RNA提取;注意事项;实验步骤;4. 4℃ 12000 rpm 离心15min,沉淀RNA,弃上清;
5. 用1 mL预冷的75%乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀,12000 rpm 4℃离
心10min,弃尽上清;
6. 重复步骤5,然后室温中自然干燥约10 min,至RNA呈半透明状即可
(用10μl枪小心吸取多余乙醇);
7. 根据RNA提取量加20-100μL DEPC(50μL)处理的水溶解沉淀,56℃水浴
10min,立即置于冰上,得到所提取的RNA溶液;
8. 如须保存,可加0.1体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.2倍体积的冰无水乙醇,充
分??匀,于-70℃低温保存。或用稳定的甲酰胺溶(4mg/mL), -20℃保存,用
时,4倍乙醇沉淀,回收RNA。;RNA纯度、浓度测定及分子完整性的鉴定;RNA电泳(甲醛变性凝胶电泳);用途:
检测细胞中基因表达水平
检测基因表达细胞中RNA
病毒的含量
直接克隆特定基因的cDNA
序列;适用于mRNA表达量解析
? Two Step RT--PCR效率高
? 使用Random和Oligo--dT
引物可以制备cDNA pool
? cDNA可长期保存;1.逆转录(RT);
;text1;;;;;;;;PCR产物生成曲线;;2.基因扩增(β-actin);PCR具有极高的灵敏度;text1;;;;SYBR green 的优缺点;② TaqMan体系;TaqMan系统的一个例子;Taqman的优缺点 ;
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