铁皮石斛种质资源主要成分差异分析及遗传多样性研究.pdf

摘 要 铁皮石斛 （Dendrobium Officinale Kimura et Migo ）是我国兰科石斛属珍稀濒 危特有种，是传统名贵珍稀中药材，具有益胃生津、滋阴清热、抗癌防老等独特 的功效。自然条件下，铁皮石斛生长环境苛刻，种子繁殖率低，自然资源极为稀 少。由于铁皮石斛自交不育，大多数生产上所用品系均是利用已有资源进行随机 杂交而成，造成在大规模生产中所用的种质资源遗传性状参差不齐，品质不稳定， 有效成分、可溶性多糖含量低，生活力弱等问题。课题组一直致力于铁皮石斛资 源的调查、收集与评价，本研究在此基础上分别从浙江、江西、云南等地共收集 到资源200 余份，经形态及地理来源及江西企业种植品种状况分析，选取浙江温 州，江西鹰潭，云南昆明和福建漳州的4 份铁皮石斛种质资源开展多糖含量、挥 发性成分测定，同时在资源库中，根据形态及地理来源差异，选取81 份种质资 源材料开展遗传多样性分析，并试图开发SSAP 分子标记，为后续遗传多样性研 究、种质资源保护及品种选育奠定基础，主要研究结果如下： （1）利用比色法测定2 月份采集的来源于浙江温州（ZJ-6 ），江西鹰潭（JX-1）， 云南昆明 （YN-1）和福建漳州 （FJ-2 ）的4 份铁皮石斛种质资源多糖含量。结果 表明：采用比色法测定多糖含量重复较好；ZJ-6 多糖含量为36.4%，JX-1 多糖含 量为 38.43%，YN-1 多糖含量为 33.13%和 FJ-2 多糖含量为 28.4% ；多糖含量 JX-1ZJ-6YN-1FJ-2 揭示收集到的4 份铁皮石斛种质资源多糖含量具有显著差 异。 （2 ）利用GC-MS 技术分别对ZJ-6、JX-1、YN-1 和FJ-2 进行挥发性成分测 定和分析。共测定出了 83 种挥发性物质，主要有酯类、醇类、有机酸类、萜烯 类和烷烃类；其中ZJ-6 中含51 种 （7 种酯类、9 种醇类、8 种有机酸类、5 种萜 烯类和11 种烷烃类），JX-1 中检测出44 种 （6 种酯类、10 种醇类、8 种有机酸 类、4 种萜烯类和 10 种烷烃类），YN-1 中有48 种 （10 种酯类、6 种醇类、8 种有机酸类、3 种萜烯类和8 种烷烃类），FJ-2 中含39 种 （3 种酯类、8 种醇类、 8 种有机酸类、5 种萜烯类和9 种烷烃类）。分析挥发性成分中药理和毒理性成 分表明，共检测到 18 种药理性成分和4 种毒理性成分，ZJ-6 中含2 种毒理性成 分，JX-1 中未检测到毒理性成分，YN-1 中有2 种毒理性成分，FJ-2 中的毒理性 成分为3 种，且在ZJ-6 和FJ-2 中毒理性成分含量最高的均为邻苯二甲酸丁十四 酯，含量分别是 0.26%和 0.22% ；YN-1 中毒理性成分含量最高的是邻苯二甲酸 I 丁十四酯和十六酸乙酯，含量均为0.26% 。研究结果揭示4 种铁皮石斛种质资源 挥发性成分种类存在显著性差异，药理性成分含量具有极显著性差异，结果可为 铁皮石斛遗传育种及种植提供一定的参考价值。 （3 ）在资源库中，根据形态及地理来源差异，选取81 份种质资源材料 （收 集于江西、浙江、云南、福建、安徽和广西6 个省份）开展遗传多样性分析，利 用75 对EST-SSR 引物进行PCR 扩增，共获得480 条条带，平均等位基因数在 1.96-5.16 之间，平均为3.16 个，平均期望杂合度 （He ）为0.5 以及香农指数 （I ） 为0.86，表明铁皮石斛具有丰富的遗传多样性。主成分分析和聚类分析发现，浙 江和云南省收集的铁皮石斛大多数与其他省份的铁皮石斛聚类成一块，来自江西 的铁皮石斛独自聚类成一块，揭示大部分种质资源可能来源于浙江和云南铁皮石 斛品种，而江西的铁皮石斛种质还有待合理开发，并有效利用，以期为铁皮石斛 产业化提供优质的铁皮石斛种质资源。 （4 ）此外，为了开发出 SSAP 分子标记对铁皮石斛全基因组进行遗传多样 性分析，本研究克隆了铁皮石斛Ty1-copia 和 Ty3-gypsy 逆转录转座子逆转录酶 序列，其片段大小分别为258-268bp 和307-406bp 。对具有转录活性的Ty1-copia 逆转录酶序列进行多个序列的比对显示了保守的‘TAFLHG ’、‘YGLK ’和 ‘YVDDM ’氨基酸片段以及Ty3-gypsy 高度保守的‘RMCVD ’基序。