生物化学技能实训 实验一 蛋白质的变性、沉淀反应 实验一 蛋白质的变性及沉淀反应.ppt

生物化学技能实训 实 验 一蛋白质的变性及沉淀反应 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义 了解蛋白质变性与沉淀的关系 实验目的 pH=pI pHpI pHpI 实验原理---蛋白质不沉淀的原因和沉淀的条件 溶 溶 溶 溶 溶 去水化膜 去水化膜 沉 去水化膜 亲水胶体 亲水胶体 亲水胶体 疏水胶体 沉淀 疏水胶体 配制各种不同pH值的缓冲液，分别将蛋白胶体溶液加入其中，通过观察沉淀出现情况，反推（估测）蛋白的pI值——沉淀最多的缓冲液pH值即视为蛋白的等电点。 在等电点时蛋白质颗粒上的净电荷为零，缺乏同电相斥的因素；同时，由于蛋白质表面的水化膜易被破坏，蛋白质容易析出沉淀---观察蛋白质的两性电离。 本实验的思路---技术路线 溶 沉 去水化膜 pH=pI （1）可逆的沉淀的反应 此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。 （2）不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。 注意： 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。 实验器材与试剂 0.2%鸡蛋清溶液； pH4.7 醋酸-醋酸钠的缓冲溶液； 3%硝酸银溶液； 5%三氯乙酸溶液； 95%乙醇； 饱和硫酸铵溶液； 硫酸铵结晶粉末； 0.1 mol·L-1盐酸溶液； 0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液； 0.05 mol·L-1碳酸钠溶液； 0.1 mol·L-1醋酸溶液； 甲基红溶液； 2%氯化钡溶液；10%NaOH；饱和的NaCl；10%醋酸。 1．盐析 步骤与结果---酪蛋白两性电离性质的观察（Ⅰ） 向试管中加5%卵清蛋白溶液5 ml 再加等量的饱和硫酸铵溶液 至有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解 倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解 将管中内容物过滤 边滴加边混匀 向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止 2．重金属离子沉淀蛋白质 向酪蛋白液中滴加0.02M HCI溶液 边滴加边混匀 至有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象 继续滴加0.02M HCI溶液 边滴加边混匀 蛋白质的两性反应（3） 继续滴加0.02M NaOH溶液 边滴加边混匀 有最大沉淀产生，观察溶液颜色变化 至沉淀消失，观察溶液颜色并解释现象 继续滴加0.02M NaOH溶液 边滴加边混匀 上述实验结果，可得出结论 Ⅰ： 酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间 pH= pI时，蛋白质溶解度最小 蛋白质是两性电解质 等电点具体是多少？ 取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂 试管号码 1 2 3 4 5 6 7 蒸馏水 2.4 3.2 — 3.0 1.5 2.75 3.38 1.00M醋酸 1.6 0.8 — — — — — 0.1M醋酸 — — 4.0 1.0 — — — 0.01M醋酸 — — — — 2.5 1.25 0.62 pH 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9 步骤与结果---酪蛋白等电点的测定（Ⅱ） 注：单位均为mL 向每个试管中各加0.5%酪蛋白溶液20滴， 加一管，立即混匀一管。 1 2 3 4 5 6 7 沉淀量 0 + +++ ++++ ++ 0 0 静置30分钟后，以0、+、++、+++、++++表示各管的混浊度，并指出哪一种pH是酪蛋白的等电点。 上述实验结果，可得出结论 Ⅱ： 4号试管沉淀量最多。 说明4号管溶液的pH值为酪蛋白的等电点，即pI=4.7。 什么是蛋白质的等电点？ 在等电点时，蛋白质溶液为什么容易发生沉淀？ 破坏蛋白质水化膜，蛋白质一定沉淀吗，为什么？ 思考题 实验项目 实验原理 试剂和器材 步骤与结果 思考题 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到某值，蛋白质颗粒上正负电荷数目相等。在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动。此时，溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点(pI)。 * 生物化学技能实训 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到某值，蛋白质颗粒上正负电荷数目相等。在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动。此时，溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点(pI)。 *