免疫学检验 器官移植的免疫检验 29 第二十八章 器官移植及免疫学检验.ppt

PCR-SSP 根据各型别HLA核苷酸碱基序列差异，设计出一套HLA等位基因的序列特异性引物，对待测DNA进行PCR扩增，因Taq DNA 聚合酶没有3′→ 5′核酸内切酶活性，引物3′端最后一个碱基是否与模板配对决定着能否扩增出产物。若将引物的3′端最后一个碱基设计在正好有差异的那个碱基序列上，则扩增产物仅需常规琼脂糖电泳，根据特异产物存在与否即可直接对HLA 进行分型。 PCR-SSCP 用PCR扩增特定的靶序列, 经变性使之成为两条单链, 然后在无变性剂的中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳。单链DNA如果存在碱基差异, 即使一个碱基的不同, 也会表现出电泳迁移率的不同, 据此可将不同型别的HLA区分开, 达到分型的目的。 SBT分型技术 首先用PCR扩增HLA的DNA片段，扩增产物进行纯化和测序，将此序列与HLA基因库的DNA已知序列进行比较，即可获得HLA的基因型别。 最可靠也最彻底的基因分型方法。 多荧光微珠免疫分析 用标记有生物素的特异性引物分别扩增HLA-A、B、DR等基因座位的特异性片段，扩增产物与已知的寡核苷酸探针（事先包被在不同颜色的磁珠上）进行杂交，洗脱没有结合的DNA片段，再与荧光素标记的亲和素结合，多荧光微珠在流式细胞仪上进行结果判读，若扩增的DNA片段能与探针结合则发荧光，不结合则无荧光。 基因芯片 首先用PCR扩增获得HLA的DNA片段，用放射性核素或荧光素标记扩增的DNA分子，再与预先点在固相支持物表面的成千上万个代表不同基因的寡核苷酸探针进行杂交， 通过放射自显影或荧光检测，杂交结果通过计算机软件处理分析后获得杂交信号的强度及分布模式图，从而反映样品中HLA的基因型别。 预防移植排斥反应 的免疫学措施 03 预防移植排斥反应的免疫学措施 移植前组织配型 免疫抑制措施 一、组织配型 （一）HLA配型 供受者HLA是否相符是移植物存活的主要条件之一，两者的匹配程度决定了移植排斥反应的强弱。 HLA系统含有多种Ⅰ类和Ⅱ类抗原基因，但多数情况下只检测HLA-DR 、A和B。不同器官的移植对HLA配型要求不同。 （二）红细胞血型抗原的配型 ABO血型必须相同或相容 ！！ （三）交叉配型 必须做HLA交叉配型！！ 方法：补体依赖的细胞毒试验（CDC) 双向MLC 流式细胞术 试验时每一标本至少做3份，同时设阳性对照和阴性对照。 二、免疫抑制措施 术后使用免疫抑制剂人工调节机体的免疫状态是目前控制排斥反应发生最主要的方式。 临床上常用的免疫抑制剂有三类： 1、化学性的免疫抑制剂　　 常见有：环孢素A、糖皮质激素、硫唑嘌呤、环磷酰胺、他克莫司麦考酚吗乙酯，西罗莫司等。 二、免疫抑制措施 2、生物免疫抑制剂　　 常见有：抗淋巴细胞球蛋白、抗细胞因子或细胞因子受体抗体、融合蛋白、反义寡核苷酸等。 3、某些中草药 如雷公藤等。 移植后的免疫监测 04 意义 早期诊断排斥反应和监测排斥危象的发生，以便及时采取措施。 项目 体液免疫水平的检测（抗体、补体） 细胞免疫水平的检测 免疫分子的监测 一、细胞免疫水平的监测 T细胞亚群及功能检测 单克隆抗体免疫荧光法和流式细胞仪测定T细胞亚群，T细胞转化试验测定T细胞功能，4h T细胞转化试验检测受者致敏T细胞。 NK细胞活性检测 形态学法、荧光标记剩余法 二、体液免疫水平的监测 血清抗体的检测 包括抗供者HLA抗体、抗供者组织细胞抗体、抗血管内皮细胞抗体、B细胞细胞毒抗体、冷凝集素等的检测。方法：CDC、交叉配型等。 血清补体的检测 CH50试验检测活性，免疫扩散和免疫比浊试验检测含量。 三、免疫分子的监测 细胞因子及其受体的检测 黏附分子的检测 其他分子的检测 C反应蛋白（CRP）、β2-微球蛋白（β2m） 器官移植面临的主要 问题和解决方案设想 05 器官移植面临的主要问题和解决方案设想 主要问题 移植排斥反应 供体不足 一、诱导同种异体免疫耐受 　　 方 案 1.诱导同种异型反应性T细胞耐受 2.阻断T细胞活化的协同刺激信号诱导T细胞无能 3.调控Th细胞向Th2亚群转化 4.T细胞疫苗的研制 二、研究异种移植 探索异种器官移植，是缓解目前器官移植 供需矛盾的手段之一，目前异种器官移植尚不能 成功地应用于临床，主要问题是术后排斥反应， 而如何解决异种移植的免疫排斥是问题的关键。 小结 Sum up 1. 器官移植的基本知识。重点