医学生物化学基础及技术 4.离子交换层析 项目四4.离子交换层析-电子教材.doc

离子交换层析 原理 离子交换就是指液相中的离子与固相上的活性基团离子的可逆交换反应。利用这个反应将要分离的混合物先在一定pH的溶液中全部解离，而后流过固定相使之与固相上的离子进行交换，吸附于固相上，再根据混合物中解离度的差别，用不同pH的溶液分别洗脱下来，达到分离混合物中组分的目的。 离子交换层析技术除大量应用于分离生物化学代谢物质的工业生产外，还广泛应用于生物化学和分子生物学的理论研究。近年来，该技术与其它技术相结合，制成了固相肽自动合成装置、氨基酸自动分析仪、核苷酸自动分析仪、气相色谱仪、蛋白质合成仪等。离子交换层析技术已经成为生化领域各个方面的基本技术之一。 二、离子交换剂的类型 离子交换层析中固相称为交换剂，它是一种高分子不溶物质，目前常用的有人工合成的树脂、纤维素、葡聚糖、琼脂糖等。在这些不溶性母体上引入不同的活性基团，即具有离子交换作用，成为各种类型的离子交换剂。引入母体上的活性基团主要分酸性和碱性两类，酸性基团能解离出H+可与溶液中阳离子交换，所以这类离子交换剂称为阳离子交换剂；碱性基团因能解离出OH-与溶液中的阴离子交换，所以这类离子交换剂称为阴离子交换剂。由于引入的酸性和碱性基团的强弱不同，这两类离子交换剂又分为强酸型和弱酸型以及强碱型和弱碱型(见表1)。 表1 常用的离子交换剂的种类及解离基团 离子交换剂的作用原理如下： 阳离子交换剂分子中具有酸性基团，能和流动相中的阳离子交换： R-SO3H++M+→R-SO3M+H+ 阴离子交换剂分子中具有碱性基团，能和流动相中的阴离子进行交换 R4-N+OH-+W-→R4-N+W-+OH- OH-+H+→H2O (M+代表溶液中阳离子，W-代表溶液中阴离子) 由于不同生物大分子的电荷密度分布不同、电荷量不等、等电点的差异及分子大小的区别，因而与离子交换剂的结合强弱也不同，当它们被结合到固定相交换基团上以后，主要依靠增加缓冲溶液的离子强度或改变酸碱度来进行洗脱。当缓冲液离子强度增加时，即增加了它与生物大分子对交换基团竟争吸时的能力把生物大分子置换下来，改变酸碱度，使缓冲溶液的pH接近生物大分子的等电点，其净电荷为零，从而可被洗脱。 (三)离子交换层析基本操作 1.变换剂的选择 交换剂的选择必须考虑到被分离物质及交换剂的性质，如被分离的物质是阳离子就应选用阳离子交换剂，反之则选用阴离子交换剂。溶液中的离子在交换剂 中交换吸附不仅受自身电荷数的影响，也受到它与离子交换剂的非极性亲和力及交换剂空间结构大小等因素影响。因此，在分离某物质时，必须根据物质的解离性能、分子大小，选择适当类型的离子交换剂。再如像分离蛋白质、核酸时，为 了不改变其生物活性，要选用条件温和的交换剂，如纤维素交换剂，而不能选用交换条件强烈的交换剂，如磺酸型树脂等。 2.交换剂的处理、转型与再生 离子交换剂在使用前必须进行处理，即将离子交换剂先用蒸馏水浸透使之充 分吸水膨胀，并用无离子水洗至澄清，以去除漂浮物及杂质等。然后用酸和碱分别处理，以除去某些不溶物。如离子交换树脂的处理方法是：先用4倍量的2 mol/L HCI浸泡4h以上，除去酸液，用无离子水洗至中性，再加4倍量2mol/LNaOH浸泡4h以上，除去碱液，再用无离子水洗至中性备用。离子交换纤维素则用0.5moL/L的NaOH和0.5mol/L的HCl处理。离子交换葡聚糖凝胶一般不用酸碱处理，使用前需在中性溶液中完全膨胀(室温1-2d，沸水浴2h)。处理过程中不需去除细小颗粒，避免强烈的搅拌，清洗时，最好用布氏漏斗除滤液，代替倾注法以减少损失。 3.装柱 首先应将柱放垂直，在柱内装入1/3的溶液，然后将处理好的交换剂用溶液稀释，一边搅拌一边加入柱内，使交换剂均匀沉降，至交换柱高1cm左右，打开下口，使溶液慢慢流出，同时不断地加入搅匀的交换剂，直至达到要求的柱高为止。装好的柱要求没有明显的分界线，不能有气泡，柱床面要平坦。装好的柱床面上要保持一层溶液，以防空气进入。 4.样品上柱 柱装完毕后，用所需的缓冲液平衡，上样时应把柱面上的溶液放出，至液面与柱床面相同高度，用滴管加入样品，打开下口，使样品进入柱床，当样品液与柱床面相平时，用少量缓冲液洗管壁，这样使样品全部进入柱内，以防止出现拖尾现象。 5.洗脱 一般是根据所用洗脱液比吸附物质具有更活泼的离子或基团，从而把吸附物质顶替出来，利用此原则选择各种洗脱液。洗脱液是由不同离子强度和不同pH的缓冲液组成，用以分离样品的不同组分。改变洗脱方式主要有分步洗脱(或分段洗脱)和连续梯度洗脱法。 (1)分步洗脱法预先配制不同离子强度的缓冲溶液，分段换用离子强度由低到高，pH相同或不同的洗脱液以洗脱生物大分子的各种组分。 (2)梯度洗脱法早期采用两个直径相同底部相通的大型容器，将离子强度低的缓冲溶液放入一容器(混合瓶)中