血液学检验 常用细胞化学染色方法 常用细胞化学方法.docx

第三章 细胞化学染色 第二节 常用细胞化学染色 七、铁染色 【原理】骨髓中的铁包括细胞内铁和细胞外铁，骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，幼稚红细胞内的铁称为细胞内铁。骨髓中的三价铁和蛋白质结合不牢固，经稀盐酸处理后而游离出来，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应（见以下反应式），生成蓝色亚铁氰化钾铁沉淀，定位于含铁的部位。根据反应的强弱就可了解骨髓中内、外铁的含量。 4Fe3++3K4[Fe(CN)6] Fe4[Fe（CN）6]3+12K+ 【材料】 1. 器材 骨髓涂片、染色缸、水浴箱、显微镜等。 2. 试剂 （1）酸性亚铁氰化钾溶液（现用现配）：取200g/L亚铁氰化钾溶液20ml，缓缓滴加5ml浓盐酸，边滴边搅拌均匀，如有白色沉淀则加少量亚铁氰化钾溶液使白色沉淀消失，注意加入亚铁氰化钾溶液的总量为25ml。 （2）2g/L核固红-硫酸铝溶液：取硫酸铝2g溶于100ml蒸馏水中，再加入核固红0.2g。置37℃水浴中振荡1小时，使之溶解，过滤后备用。 【操作步骤】 1. 干燥骨髓涂片用甲醇固定10分钟，待干。 2. 标本片放入酸性亚铁氰化钾溶液中，37℃，染色30分钟。 3. 用蒸馏水冲洗，待干。 4. 用核固红染液复染10～15分钟。 5. 流水冲洗，待干，镜检。 【注意事项】 1. 玻片需经去铁处理。将新玻片用清洁液浸泡24小时，取出后反复水洗浸入95％酒精中24小时，晾干，再浸泡在5％盐酸中24小时，取出后用双蒸水反复清洗玻片，取出烘干后备用。 2. 骨髓取材合格。细胞外铁存在于骨髓小粒中，故选择骨髓小粒丰富的涂片进行铁染色。取材不佳时，影响实验结果。 3. 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配剂。加浓盐酸时要慢，尤其不要把浓盐酸直接加到全量的亚铁氢化钾溶液中，否则会出现沉淀不溶解的现象。 4. 固定时间过长会导致阳性率降低 5. 基质液中取出的骨髓涂片，用小水流。冲洗或冲洗玻片背侧面，以免冲掉骨髓小粒。 6. 染色时HCI的浓度过低，会导致阳性率降低。 7. 已做过瑞特染色的陈旧骨髓涂片，可浸入甲醇中至颜色退去，再行铁染色。 【参考区间】 1. 结果判断 （1）幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 （2）细胞内铁：用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录细胞中含有蓝色铁颗粒细胞（铁粒幼红细胞）的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼Ⅳ型细胞红细胞分为四型，详见表3-15。 表3-15 铁染色细胞内铁结果判断方法 实验结果 细胞 Ⅰ型细胞 Ⅱ型细胞 Ⅲ型细胞 Ⅳ型细胞 幼红细胞内含1～2个小铁颗粒 幼红细胞内含3～5个小铁颗粒 幼红细胞内含6～10个小铁颗粒，或1～4个大铁颗粒 幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒 环形铁粒幼红细胞是指幼红细胞胞质内铁颗粒在5颗以上，围绕核周1/3以上者。 （3）细胞外铁：用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注意蓝色铁颗粒的存在，常分为五级，见表3-16，图3-7。 表3-16 铁染色细胞外铁结果判断方法 实验结果 染色情况 （－） （+） （++） （+++） （++++） 无颗粒 有少数铁颗粒或偶见铁小珠 有较多的铁颗粒或小珠 有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状 有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆 2. 细胞外铁（+）～（++）；细胞内铁阳性率为12％～44%，平均21.4％，以Ⅰ型为主，少数为Ⅱ型，Ⅲ、Ⅳ型及环形铁粒幼红细胞不见，见图3-8。 图3-7骨髓细胞外铁染色； 图3-8骨髓细胞内铁染色：1.环形铁粒幼红细胞；2.铁粒幼红细胞 【临床意义】 1. 缺铁性贫血，缺铁性贫血时骨髓细胞外铁明显减少或消失；细胞内铁早期不减少或轻度减少，以Ⅰ型为主，重症缺铁性贫血时铁粒幼细胞明显减少，甚至呈阴性，所见铁颗粒细小、色浅，以Ⅰ型为主，Ⅱ型极少见，Ⅲ型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁和内铁可迅速增多至恢复正常，铁染色可辅助诊断IDA（缺铁性贫血）及指导IDA的临床治疗。 2. 部分血小板减少患者可出现不同程度铁减少，可能与患者持续失血有关。真性红细胞增多症患者细胞内铁、外铁均较低。 3. 铁粒幼细胞贫血患者细胞外铁增多，多见粗颗粒的Ⅲ型与Ⅳ型铁粒幼细胞。出现一定比例的环形铁粒幼细胞是诊断的重要依据。 4. MDS-RAS细胞内、外铁增多，可见环形铁粒幼细胞，且比率大于15%，是诊断骨髓增生异常综合征-铁幼粒细胞性贫血的重要指标。 5. 非缺铁性贫血如溶血性贫血、再生障碍性贫血、巨幼细胞贫血、白血病和多次输血患者，细胞内、外铁通常增高，内铁以Ⅰ型、Ⅱ型为主，可见Ⅲ型，Ⅳ型罕见。 6. 细菌感