6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒说明书.docVIP

第 PAGE 1页，共2页 货号: QS1102 规格：50管/48样6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）试剂盒说明书 紫外分光光度法 注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。 测定意义： G6PDH广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是磷酸戊糖途径的关键酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化为 6 -磷酸葡萄糖酸内酯，同时将NADP+还原为NADPH，供生物合成及维持细胞内的还原状态用。因此6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。 测定原理： G6PDH催化NADP+还原生成NADPH，在340 nm下测定NADPH增加速率。 自备实验用品及仪器： 紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。 试剂组成和配制： 提取液：液体60 ml×1瓶，4℃保存； 试剂一：液体50 ml×1瓶，4℃保存； 试剂二：粉剂×1支，-20℃保存；用时每支加550μl双蒸水充分溶解备用；剩余的4℃保存一周； 试剂三：粉剂×1支，-20℃保存；用时每只加550μl双蒸水充分溶解备用；剩余的4℃保存一周； 操作步骤： 一、样品测定的准备： 1、细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（ml）为500~1000:1 的比例（建议500万细菌或细胞加入1ml提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积（ml）为1:5~10 的比例（建议称取约0.1g组织，加入1ml提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃ 3、血清（浆）样品：直接检测。 二、测定操作： 1、分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。 2、将试剂一置于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）水浴中预热10min左右。 3、加样表 试剂名称（μl） 测定管 试剂一 750 试剂二 10 试剂三 10 样本 30 加样本的同时开始计时；混匀，在340 nm波长下记录1min时的初始吸光度A1和6min时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。 注意事项： 若ΔA大于0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。或将反应时间缩短至2min，使A2-A1小于0.5，可提高检测灵敏度。 G6PDH 活力单位的计算： 1、血清（浆）G6PDH活力的计算: 单位的定义：每ml血清（浆）每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/ml）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷V样÷T=857×ΔA 2、组织、细菌或细胞中G6PDH活力计算： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(V样×Cpr) ÷T=857×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=857×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADPH定义为一个酶活力单位。 G6PDH（U/104 cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.715×ΔA V反总：反应体系总体积，8×10-4 L；ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.03 ml；V样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5