7α-HSDH的基因筛选、蛋白表达、功能研究及分子改造.pdf

中文摘要 摘 要 熊胆是一种传统的珍稀药材，是棕熊或黑熊的胆囊。熊去氧胆酸（UDCA ）是 熊胆的主要药用成分，其与牛磺酸结合形成牛磺熊去氧胆酸（TUDCA ），TUDCA 被广泛应用于各种肝胆疾病的治疗。目前 TUDCA 主要是通过熊胆引流或化学合 成的方法来获取，但这两种方法对生态和环境不友好。随着生物技术和工程技术 的融合发展，应用生物催化技术来大规模制备 TUDCA 将成为可能。本课题组前 期发现，在体外，可以以 7α-HSDH 为催化剂催化 TCDCA 发生 7α-脱氢生成 T7-KLCA ，再进一步以7β-HSDH 为催化剂催化T7-KLCA 加氢而生成TUDCA 。 因此，7α-HSDH 是体外应用生物催化技术制备TUDCA 的关键酶之一。 7α-HSDH 的热稳定性和催化活性是决定其能否适应工业化生产的关键因素。 本文以获取热稳定性好，催化活性高的7α-HSDH 为目的，在黑熊肠道微生物宏基 因组数据库中获得了一个新的7α-HSDH （命名为St-2-2 ），系统的研究了St-2-2 的 酶学性质。基于生物信息学分析，进一步对其羧基端进行了分子改造，获得了热 稳定性与活性都提高的突变体，并初步探讨了突变体I255Q 热稳定性提高的原因。 本研究扩展了7α-HSDH 的天然酶库，为应用生物催化技术大规模制备TUDCA 提 供了新的资源。 主要研究结果和结论如下： ①基于本课题组前期获得的黑熊肠道微生物宏基因组数据库，本文挖掘了一 个新的 7α-HSDH ，命名为 St-2-2 。1）粒径排阻色谱和质谱分析表明 St-2-2 是由 28.3 kDa 的亚基构成的四聚体（113.2 kDa）。2 ）对其催化活性研究发现，St-2-2 对TCDCA、GCDCA、TCA、GCA 的催化活性显著优于本课题组前期发现的5 个 7α-HSDHs 。其中，St-2-2 对TCDCA 的催化活性显著高于S1-a-1 （p0.01 ）、S1-a-2 （p0.05 ）、H1-a-1 （p0.001 ）、H1-a-2 （p0.001 ）和 Y1-a-1 （p0.001 ），其活性 分别是它们的1.7 倍、1.2 倍、10.3 倍、15.8 倍、13.7 倍。从催化活性上看，St-2-2 在生物合成TUDCA 上具有显著的优势。 ②以TCDCA 为底物，对St-2-2 的酶学性质进行了系统研究。1）St-2-2 最适 pH 研究显示其在pH 为10.0 时显示出最佳酶活，表明其为嗜碱酶。2 ）St-2-2 最适 o 温度研究显示其在温度为 35 C 时显示出最佳酶活，表明其为嗜温酶。3 ）St-2-2 o o 的热稳定性研究显示，St-2-2 在4 C 处理80 h 仍保留65.4%的酶活。St-2-2 在37 C o 环境中的热稳定性显著优于实验室前期发现的5 个7α-HSDHs 。St-2-2 在37 C 处 理30 h 仍保留65.5%的酶活，而S1-a-1、Y1-a-1 在同等条件下完全失去活性，而 S1-a-2 、H1-a-1、H1-a-2 在同等条件下的残余酶活分别为 51.2%、38.9%、40.1% 。 I 重庆大学硕士学位论文 4 ）金属离子对St-2-2 酶活的影响研究表明Na+ ，Mg2+在适当的浓度下对St-2-2 的 + 2+ 酶活具有激活作用。当Na 浓度达到5 mM 时可使酶活增加14.3% ，当Mg 达到 2.5 mM