第6章-分子生物学研究方法(下)PPT课件.ppt

. 6.3.2 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system) 真核生物转录调控因子具有组件式结构(modular)特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域，其中DNA结合结构域(binding domain，BD)和转录激活结构域(activation domain，AD)是转录激活因子发挥功能所必须的。 BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的BD和AD所形成的杂合 蛋白却能行使激活转录的功能。 酵母双杂交的基本原理示意图 1. 等离子表面共振技术 将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。 6.3.3 体外蛋白质相互作用技术 2. 免疫共沉淀技术 将靶蛋白的抗体连接到固体基质上，再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中，用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底部或微膜上。 3. GST融合蛋白沉降技术 利用GST对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相互作用蛋白。 4. 细胞内蛋白质相互作用研究——荧光共振能量转移法(FRET) FRET荧光能量转移有三个基本条件： 给体与受体在合适的距离（1～10 nm）； 给体的发射光谱与受体的吸收光谱有 一定的重叠（这是能量匹配的条件）； 给体与受体的偶极具有一定的空间取向（这是偶极-偶极耦合作用的条件）。 6.3.4 染色质免疫共沉技术（Chromatin Immuno precipitation Assay, ChIP) 基因表达:反式因子和顺式作用元件之间相互作用。 真核生物的基因组DNA以染色质的形式存在。 研究蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用是阐明真核基因表达机制的基本途径。 ?基因表达调控 功能基因组学? 染色质免疫沉淀实验(ChIP) 研究体内DNA－蛋白质相互作用的重要工具。 它不仅可以灵敏地检测目标蛋白与特异DNA 片段的结合情况，还可以用来研究组蛋白与基因表达的关系。 ChIP原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物 将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段 通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段 对目的片断的纯化与检测 RNAi 研 究 史 20多年前，在对矮牵牛花（petunias）进行的研究中发现协同抑制现象“cosuppression”，导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制(安德鲁·法尔1998年在《自然》)。 96年前后，研究发现 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-1 基因的表达；三年后，首次将双链RNA注入到线虫中,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默效果，这种技术的成熟使得大规模筛选线虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究 。 在果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型。 2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多种细胞中也取得了成功。 6.3.5 RNAi（RNA干涉）技术及其应用 牵牛花（petunias） 协同抑制现象“co-suppression， 线虫的RNAi （左）两线虫带有含普遍性表达的GFP报告基因重组质粒的 表达品系。 （右）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体GFP 信号消失（头部区域有些神经元对该效应具有抗性)。 RNAi 应答的基本特征: 3、RNAi效应可以在线虫体内传播即传播效应。 1、靶基因内源性序列不发生改变，即RNAi不引起稳定 的遗传改变。 2、发现细胞质中靶mRNA水平下降，但细胞核的mRNA前 体数量未受影响。相应原核生物，位于操纵子的基因在 RNAi不发生交叉反应。说明RNAi是在转录后发挥 作用(PTGS) 。 4、每个细胞仅需要少量siRNA分子就可对大量mRNA发挥 作用，提示存在某些放大和/或催化活性的因素在起作用 例如： 依赖RNA的RNA聚合酶 （RdRP）的发现 线虫中的随