微生物育种技术 项目一 种子的制备过程、项目二 种子质量的控制、单元八 工业菌种扩大培养技术、微生物育种技术 单元八——菌种的扩大培养技术 项目一、项目二.ppt

单元八 工业菌种的扩大培养技术 种子扩大培养：将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 菌种扩大培养的目的：为发酵提供足够数量的代谢旺盛的种子（纯种培养物）。 优良种子应具备的条件 菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，迟缓期短； 生理性状稳定； 菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求； 无杂菌污染； 保持稳定的生产能力。 * 一 种子的制备过程 种子制备的过程大致可分为： 实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段 * 制备过程： 实验室：保存菌种→斜面上活化→悬浮液（如为孢子叫孢悬液）→ 生产车间：一级种子罐→二级种子罐→发酵罐 * 二、实验室阶段 1.细菌菌体的制备 细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方。 培养温度一般为37?C。 细菌菌体培养时间一般为1-2天，产芽孢的细菌培养则需要5-10天。 * 三、生产车间种子制备 实验室制备的液体种子移种至种子罐扩大培养。 * 1.种子罐的作用 主要是使菌体数量进一步增加，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。 种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。 * 2.种子罐级数的确定 种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数 1．种子罐级数的决定 （1）根据生产菌的特性：生产繁殖快慢，如生长繁殖快则级数少 （2）根据发酵罐的接种量： （3）发酵罐与种子罐的体积比 V发酵罐/V种子罐 比数越大，种子级数越大。 * 发酵罐接种量少，则级数少，接种量决定于 ①根据菌的生长特性（生长快接种量少），看接种菌，如细菌接种量1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少的，如制霉菌素，只用1%） ②根据种子质量：活力高则接种量少 现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-25%， * 大接种量优点和缺点: 优点： a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则整个合成时期就增加了，不少种子液中会有水解酶类，有利于发酵利用。 b.可有效地防止发酵罐的前期染菌，有相当部分的特别是抗生素的生产，种子液中就有抗生素，可利用之抑菌。 缺点： a.要求种子罐多 b.种子液中含代谢废物，副产物，在发酵罐中可能抑制菌的生长和产物的合成。 具体接种多少要经过实验和生产检验。 * 细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少，二级发酵。 摇瓶→种子罐→发酵罐 * 确定种子罐级数需注意的问题 种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会 种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 * 四、影响种子质量的因素及控制 培养基 培养条件 种龄 接种量 * 1.培养基 营养成分适合种子培养的需要 选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； 营养上要易于被菌体直接吸收和利用； 营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高 营养成分要尽可能与发酵培养基相近。 * 2.培养条件 （1）温度 （2）通气量 在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。 * 3.种龄 种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。 通常种龄是以处于生命力旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。 不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。 4.接种量 接种量：接入的种子液体积和接种后整个发酵液体积的比例。 四. 种子质量的控制措施 必须保证生产菌种的稳定性 提供种子培养的适宜环境条件，保证无杂菌侵入 四. 种子质量的控制措施 1. 菌种稳定性的检查 少量菌种--无菌生理盐水--递增稀释--平板划线培养。 挑出形态整齐，孢子丰满的菌落进行摇瓶试验，测定其生产能力。 2. 无菌检查 种子液平板划线、斜面培养用肉眼观察是否有异常菌落、异常现象及镜检是否有杂菌。 * 五、种子质量标准 1.细胞或菌体 单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐 有的还要求有一定的排列或形态 2.生化指标 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化。 * 3.产物生成量 在抗生素