植物组织培养 技能训练 原生质体的分离培养与细胞培养-原生质体的分离培养.pptx

原生质体培养与体细胞杂交 ——原生质分离培养;工作任务;;实践知识;（三）原生质体分离(一步分离法) 取前面培育的无菌苗，用刀片切下下胚轴后撕去表皮，纵剖若干细条，再横切成2～3mm 小段放入酶液Ⅰ中。撕去叶片的小表皮，切成小块放入酶液Ⅱ中。每10mL酶液中约放2g材料，在26℃下酶解3～4h，其间摇动几次。 ;（四）向日葵下胚轴原生质体的纯化（漂浮法） ; 向日葵下胚轴原生质体的纯化具体方法步骤如下： 1.将酶解后的向日葵下胚轴原生质体用200目不绣钢网过 滤，除去未解离的组织，再用22%的蔗糖溶液冲洗网上残渣（蔗糖溶液体积与酶液相等）。 2.滤液（即酶液和蔗糖液）装入离心管，以600r/min离心3～6min。 3.待原生质体漂浮后吸去下面的液体及残渣。;4.加入17%蔗糖溶液6～8ml，混匀后离心（600r/min，5分钟），吸去下面的液体及残渣，重复一次。 5.加入1～2ml 0.16mol/LCaCl2?2H2O（加1%MES，pH=5.8），使原生质体的密度在2103g/ml条件下悬浮，以备后面进行原生质体培养和融合之用。 ; （五）向日葵子叶原生质体的纯化（界面法） ;原生质体分离及纯化; 禾本科植物： 愈伤组织或悬浮细胞。;供体材料的重要性 供体材料是影响原生质体培养能否成功的关键。 理论上植物的各种器官、组织和细胞都可作为分离原生质体 的供体材料，但目前常用叶片、分裂旺盛和再生能力强的愈 伤组织及悬浮细胞系，尤其是胚性愈伤组织或胚性悬浮细胞 系是最理想的原生质体分离材料。;;1、机械分离法;（1）确定酶的种类;（2）酶液的配制;（3）分离原生质体;图示一步法原生质体分离过程（以叶片为例）;原生质体纯化与活力测定;1、离心沉淀法;2、漂浮法; 3 、界面法(不连续梯度法)?;（二） 原生质体活力测定;影响原生质体培养的因素 原生质体活力 原生质体起始密度：过低过高均不利 渗透压稳定剂：常用甘露醇 培养基成分 培养条件：初期培养是暗培养 植物种类;一、培养基; （1）碳源 葡糖糖是最佳碳源，蔗糖单独使用效果较差，与葡萄糖配合使用效果较好。碳源的作用一是保持细胞渗透压，另一方面是作为细胞分裂时的能源物质和组成原料。 （2）氮源 适当浓度的谷氨酰胺有利于原生质体的的细胞再生、分裂、生长。NH4+浓度太高不利于原生质体的培养，有毒害作用，在马铃薯上已有研究证明。 ;（3）生长物质 生长素和细胞分裂素是细胞分裂分化所需要的通常物质，原生质体培养也需要这些生长调剂。但不同植物对生长调节剂的浓度要求不同。 （4）钙镁 研究指出在原生质体培养中增加Ca2+的浓度。可增强原生质体的稳定性，提高原生质体的分裂能力率。明显改变细胞内外的离子交换。 ;（5）渗透压 最常用的渗透调节剂是山梨醇和甘露醇，两者常结合在一起配合使用。现在很多人用葡萄糖代替糖醇。 （6）pH及灭菌 一般pH为5.6-6.0之间，培养基偏酸不利于与原生质体的培养。 （7）常用培养基：MS、B5、N6.;2、养条件 培养温度25-27度，光照16h/d左右，静置为主，但为了不使细胞集聚，最初几天需要经常轻轻摇动，以助通气。有些材料不需要光照，所以依材料而定培养条件。 3、与同种材料的不同基因型 ;二、培养方法;;2、平板培养;3、双层培养法（固、液培养）;4、饲养层培养;方法二：X-射线杀死原生质体，与0.7%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.7%琼脂混合，培养于饲养层上。;1、细胞壁再生： 原生质体培养后1-2天即可合成完整细胞壁，只有形成完整细胞壁的细胞才能进入细胞分裂。 2、细胞分裂、愈伤组织或胚状体形成 3、植株再生途径： （1）通过愈伤组织形成不定芽；该途径占多数。 （2）原生质体再生细胞直接形成胚状体。;第一次分裂;;烟草原生质体培养实验过程示意图;