中药综合检验技术 薄层色谱法 薄层色谱法-操作方法.ppt

山东中医药高等专科学校 Shandong College Of Traditional Chinese Medicine 无机与分析技术 基础化学教研室 王雷清 薄层色谱法-操作方法 薄层色谱法操作方法 四、操作方法 1.制板 2.点样 3.展开 4.显色 5.定性和定量分析 四、操作方法 薄层色谱法的一般操作程序可分为制板、点样、展开、斑点定位、定性定量分析五个步骤。 （一）制板 常用的薄板类型有： 软板（硅胶H板、氧化铝板）、硬板 （硅胶G板、氧化铝G板、硅胶CMC-Na板、氧化铝CMC-Na板)、F板(F254板、F365板)。F板为在吸附剂中加有波长为254nm或365nm的荧光物质。 1. 将一定粒度的吸附剂（固定相，例如硅胶、活性氧化铝、纤维素等）均匀地涂铺在表面光洁的玻璃板或塑料平板上，制成薄层板。 吸附剂就其性质而言，可分为有机吸附剂（如聚酰胺、纤维素和葡聚糖等）和无机吸附剂（如氧化铝、硅胶、硅藻土、磷酸钙、磷酸镁和硅酸钙镁等）。最常用的是氧化铝和硅胶，它们的吸附性能好，适用于多种化合物的分离。 常用的吸附剂厚度为0.5～2.5mm，色谱板的尺寸一般为20cm×20cm或20cm×40cm。薄层厚度与薄层板的尺寸限制了PTLC可以分离的样品量。 1.0mm厚的硅胶板最多可上样5mg／cm2。硅胶是最常用的吸附剂，可用它来分离亲脂或亲水性物质。 　 TLC板可以自己制备，也有预制板出售。自制TLC板的优点在于吸附剂的厚度及组成可调节(最厚可达5mm)，也可以在吸附剂中掺入硝酸银及缓冲物质。 硅 胶 黏和剂 混合 平铺 涂铺器 自然干燥一夜 105～115℃ 活化 煅石膏或 羧甲基纤维素钠水溶液 注意事项 调制时慢慢搅拌，勿使产生气泡。 均匀涂布在玻璃板上，摇动摊平，晾干。 使用前放入烘箱内，在105-115℃左右烘干40- 50min。冷却后使用。 （二）点样 1．样品溶液的制备 溶解样品的溶剂，尽量避免用水为溶剂。 2．点样量 点样量的多少与薄层的性能及显色剂的灵敏度有关。 3．点样方法 2. 把待分析试样的溶液滴加在薄层板的起始线上（点样），晾干 薄层板 试样 原点 　　 点样是进行TLC分离的一个最关键的步骤。上样之前薄层板最好先用溶剂展开一次，以减少所需化合物从吸附剂洗脱下来时可能混入的杂质。 样品溶解：上样前先将样品溶于少量溶剂，难挥发性溶剂可引起点样带变宽，因此最好选用挥发性溶剂(如己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等)， 最好用与展开剂极性相似的溶剂，应尽量使点样后溶剂能迅速挥发，以减少色斑的扩散。水溶性样品，可先用少量水使其溶解，再用甲醇或乙醇稀释定容。 点样示意图 反应混合液样 原料样 1-2cm 1cm≤点间距≤1.5cm 点样直径≤2mm 点样注意事项 a.样品的浓度应在5％～10％左右。点样带应尽可能狭窄，以获得更好的分离效果。溶解样品的溶剂要尽量避免用水，因为水溶液斑点容易扩散，且不易挥发。 b.适当的点样量，可使斑点集中，点样量过大，易拖尾或扩散；点样量过少，不易检出。点样量多少，应视薄层的性能及显色剂的灵敏度而定，此外还应考虑薄层的厚度。一般是几微克到几十微克。 c.尽量用小的点样管，如果有足够的耐性，最好只用1微升的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。 （三） 展开 展开的过程就是混合物分离的过程，它必须在密闭的展开槽（多数是长方型展开槽）或直立型的单槽色谱缸或双槽色谱缸中进行。 展开方式：近水平展开 、上行展开 、多次展开 、双向展开等。 3.把点有试液的薄层板浸入到作为展开剂的流动相中（不要把试样点浸入），流动相装在加盖的层析缸中，并具有一定饱和的流动相蒸气压。 展开示意图 展开： 将点好样的薄板与流动相接触，使两相相对运动并带动样品组分迁移的过程称为展开。　　 　 一般硬板常用上行法展开。将点样后的薄板直立于已盛有展开剂的直立形层析槽的凸出处，不接触底部的展开剂，加盖饱和，再迅速将薄板置于槽底使之浸入展开剂中展开，直至展开剂上升一段距离（一般约15cm），取出薄板，用铅笔画出溶剂前沿位置。 把薄层板放入层析缸中，底端浸入适当溶剂。 注意事项： （1）色谱槽或色谱缸必须密闭良好：为使色谱槽内展开剂蒸气饱和并维持不变，应检查玻璃槽口与盖的边缘磨砂处是否严实 。 （2）注意防止边缘效应：边缘效应是指同一组分的斑点在同一薄板上出现的两边缘部分的Rf值大于中间部分的Rf值的现象。因此，在展开之前，通常将点好样的薄板置于盛有展开剂的色谱缸内饱和约一刻钟（此时薄板不得浸入展