《医学分子生物学》课件：第二十五章 基因诊断与基因治疗.ppt

（四）将治疗基因导入人体 将外源基因直接注入体内组织器官，使其进入细胞并表达。 基因递送 gene delivery 间接体内疗法 ex vivo 直接体内疗法 in vivo 从体内取出靶细胞，培养 （携带治疗基因） 筛选 扩大繁殖 回输体内，治疗基因在体内表达 重组体导入 基因导入细胞 生物学法 非生物学法 病毒载体介导法 特点： 基因转移效率高， 但安全问题需要重视。 物理或化学法 特点： 操作简单、安全 但是转移效率低。 （五）治疗基因表达的检测 无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。 方法： PCR RNA印迹 蛋白印迹 ELISA DNA印迹技术： 检测基因是否整合到基因 组及整合部位 三、基因治疗的临床应用现状 1. 单基因遗传病的基因治疗 单基因遗传病：只受一对等位基因影响而发生的疾病。 设计方案相对容易，例如镰刀状红细胞性贫血、α-地中海贫血、血友病等。 基本方法：通过一定手段把正常基因导入到患者体内，表达出正常功能蛋白。 2.针对多基因病的基因治疗 多基因病：由多个基因相互作用，并受环境因素影响而发生的疾病，如高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肿瘤等。 针对癌基因表达的基因沉默 针对抑癌基因的基因增补 针对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入 针对肿瘤血管生成的基因失活等 恶性肿瘤的基因治疗包括： 待解决的问题： ① 缺乏高效、靶向性的基因转移系统 ② 缺乏切实有效的治疗靶基因：疾病相关基因认识有限 ③ 对治疗基因的表达还无法做到精确调控，也无法保证其安全性 ④ 缺乏准确的疗效评价：常规治疗失败或晚期患者 * * * 目录 目录 第二十五章 基因诊断和基因治疗 Gene Diagnosis and Gene Therapy 第一节 基 因 诊 断 Gene Diagnosis 基因诊断的优势： ① 可在源头上识别基因正常与否，属于“病因诊断” ② 针对特定基因，特异性强 ③ 所用的PCR等技术具有放大效应，故灵敏度高 ④ 适用性强，诊断范围广 是指利用分子生物学技术和方法直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。 基因诊断的定义： 、基因诊断的主要对象和样品来源 主要是DNA分子，涉及到功能分析时，还可定量检测RNA（主要是mRNA）和蛋白质等分子。 临床上可用于基因诊断的样品有血液、组织块、羊水和绒毛、精液、毛发、唾液和尿液等。 对象： 样品来源： 二、基因诊断技术 分类 定性分析 定量分析 基因分型 检测基因突变 测定基因拷贝数 测定基因表达产物量 基本流程： 基因诊断的基础 核酸抽提 目的序列扩增 分子杂交 信号检测 核酸分子杂交 DNA序列分析 几种技术联合使用 （一）基因缺失或插入的诊断 1．DNA印迹法 可检测样品的基因型及或插入片段的大小 | | BgI II BgI II 5.2kb | | BgI II BgI II 4.6kb ? ? Homo Hetero Normal 5.2kb 4.6kb β-地中海贫血： β-珠蛋白基因3末端缺失0.6kb 2．PCR法 正常 异常插入 正 异 标 体内疾病相关基因缺失或突变 病原微生物基因存在与否 （二）点突变的基因诊断 1．等位基因特异性寡核苷酸（ASO）分子杂交 一对探针：针对已知突变，分别合成一对寡核苷酸探针，其中一个为野生型探针(与无突变序列互补)，另一个是突变型探针(与突变序列互补)，突变碱基及对应的正常碱基置于探针中央。 2．反向点杂交 是改进的 ASO技术。一次检测可以同时筛查多种突变，大大提高了基因诊断效率 。 3．变性高效液相色谱 在PCR中，待测DNA单链产物可以随机与互补链结合形成双链，若存在点突变，则出现异源双链DNA。 在相同的部分变性条件下，异源双链因有错配区而更易变性，被色谱柱保留时间短于同源双链，故先被洗脱下来（色谱图表现为双峰或多峰的洗脱曲线）。 （reverse dot blot，RDB） 原理和结果判断与PCR/ASO相同。 不同：探针固定于膜上，PCR产物在液相中。 （可检测未知点突变） 4．DNA序列分析 用于基因突变类型已明确的遗传病的诊断及产前诊断。 ——诊断基因突变最直接的方法 左侧正