《医学分子生物学》课件：常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 本技术的建立是基于对酵母转录激活因子GAL4分子的认识。 GAL4分子有DNA识别区（BD）和促进转录的活性区（AD），这两个区域如果被分开将失去对下游基因表达的激活作用，但如果分开后的BD和AD又分别融合了具有配对相互作用的两种蛋白质分子后，就可以依靠所融合的蛋白质分子之间的相互作用而恢复对下游基因的表达激活作用。 （二）酵母双杂交技术的基本原理和用途 酵母双杂交系统的应用 证明两种已知基因序列的蛋白质可以相互作用的生物信息学推测。 分析已知存在相互作用的两种蛋白质分子的的相互作用功能结构域或关键的氨基酸残基。 将拟研究的蛋白质的编码基因与BD基因融合成为“诱饵”表达质粒，可以筛选AD基因融合的“猎物”基因表达文库，筛选未知的相互作用蛋白质。 酵母细胞作为宿主细胞的优点： 1、易于转化，便于回收扩增质粒。 2、具有可直接进行选择的标记基因和特征性报告基因。 3、酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。 电泳迁移率变动测定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或称凝胶迁移变动实验(gel shift assay)最初用于研究DNA结合蛋白与相应DNA序列间的相互作用，可用于定性和定量分析，已经成为转录因子研究的经典方法。目前这一技术也被用于研究RNA结合蛋白和特定RNA序列间的相互作用。 二、DNA-蛋白质相互作用分子分析技术 （一）电泳迁移率变动测定 DNA结合蛋白如果与DNA探针片段结合，其分子量会增大，导致在凝胶中的电泳速度慢于游离型探针，即表现为电泳条带的相对滞后。 在实验中如果预先标记好待检测的DNA探针，再将标记好的探针与细胞核提取物温育一定时间，使其形成DNA-蛋白质复合物，然后将温育后的反应液进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后用放射自显影等技术显示出标记DNA探针的条带位置。 （一）电泳迁移率变动测定原理 放射自显影 未结合探针 结合有蛋白的探针 标记探针 1X 1X 1X 1X 核蛋白提取物 1X 10X 10X 未标记探针 10X 凝胶迁移实验结果示意图 染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可以研究体内DNA与蛋白质在染色质环境下相互作用的主要方法。 （二）染色质免疫沉淀法 在活细胞状态下，用化学交联试剂固定蛋白质-DNA复合物，并通过超声或酶处理将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，再利用PCR技术特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息， （二）染色质免疫沉淀法基本原理 染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图 Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。 Southern 法可用于检测特异的DNA序列片断、基因定位、分子量测定等。 * DNA多态（DNA Polymorphism）： 群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。 它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。 PCR - 限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP) PCR-RFLP： PCR扩增包含待测位点的DNA片段 用识别该位点的限制性内切酶水解 琼脂糖凝胶电泳观察结果。 如果疾病的相关基因突变后引起了酶切位点的改变，则可用该技术诊断。 TAGAG TACAG 正常 突变 突变 正常 Marker 碱基点突变后引起了酶切位点消失。 碱基无突变，保留原有酶切位点。 逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 （一）逆转录PCR技术 三、几种重要的PCR衍生技术 原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相结合的一种最佳方法。 （二）原位PCR技术 （三）实时PCR技术 实时PCR(real-time PCR)技术通过引入荧光标记分子，并使荧光信号强度与PCR产物量成正比，对每一反应时刻的荧光信号进行实时分析，即可计算出PCR产物量