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生物科技行业神经生物学的形态学研究方法 第一部分　神经生物学的形态学研究方法 一、研究神经细胞的形态及细胞构筑的方法 （一）尼氏（Nissl）染色法 原 理 用碱性染料染神经组织 常用染料 焦油紫、硫堇、中性红 结 果 尼氏小体被染色，背景无色。 用 途 皮质的分层、分区、脊髓灰质的分层、核团的分区、细胞的构筑 （二）高尔基（Golgi）镀银染色法 原 理 铬银与脂蛋白形成复合物，在细胞 膜系统的间隙内形成结晶 结 果 整个细胞为黑色 用 途 显示整个细胞的全貌 二、研究神经径路的方法 （一）溃变法 原理 神经元胞体或纤维损伤后远侧部分发生顺行变性（纤维交替膨胀和狭窄，呈念珠状继而呈颗粒状），可用镀银法显示或电镜观察。 胞体发生逆行变性（胞体内色质溶解，胞体肿胀，核偏向胞体的一边），可用尼氏法显示。 应用 研究纤维联系。 （二）辣根过氧化物酶（HRP）标记法 原 理 HRP注入神经组织或脏器—逆行、顺行、 过节标记—H2O2、色原酶反应—呈色 试 剂 HRP： 1.游离HRP 2.结合HRP(WGA-HRP、CT-HRP） 色原： 1.二氨基联苯胺(DAB) 2.二盐酸联苯胺(BDHC) 3.邻-联茴香胺(OD) 4.四甲基联苯胺(TMB) 稳定剂: 硝普钠、钨酸钠 用 途 研究脏器的神经支配、中枢内核团间的联系等。还可与免疫组织化学、电镜技术等结合。 （三）荧光素轴突逆行传递标记法 原 理 将荧光物质注射至神经元的轴突分布区, 经分支的末梢吸收后，循轴突逆行输送至胞体。在荧光显微镜 下可看到胞体内呈现荧光标记物。 荧光素 Furogold FB-NY GB-NY TB-Bb PI-Bb EB-DAPA 应 用 研究神经元的轴突分支至不同部位的投射。 （四）放射自显影示踪技术 原 理 将放射性同位素3H等标记的氨基酸导入神经组织，氨基酸被神经元摄取后在胞体内合成蛋白质，沿轴突顺行运输，分布于整轴突和末梢，同位素产生的核射线使照相乳胶感光，根据感光银粒所在部位和黑度判断放射性示踪剂的位置和数量，从而确定神经纤维的路径。 示踪剂 3H -脯氨酸 标记终末、跨突触标记 3H -亮氨酸 标记终末、纤维 3H -HRP酶蛋白 与HRP结合双标记 用 途 研究神经元的传出路径 （五）2-脱氧葡萄糖放射自显影法 原 理 2-DG能与葡萄糖竞争和6-磷酸葡萄糖异构酶结合，但不能转化为相应的磷酸果糖，因此滞留在细胞中。将2-DG标记上放射性同位素，就可追踪中枢神经系统中各种神经结构的代谢率。 结 果 在感光底片上，代谢率较高的核团和区域银粒较密。 用 途 显示处于兴奋状态的神经元链。 （六）植物凝集素标记法 原 理 凝集素通过神经细胞膜上不同受体的介导而被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用免疫组化的方法显示。 凝集素 麦芽凝集素（WGA） 可与HRP、荧光素结合 菜豆凝集素（PHA-L） 用 途 顺行或逆行追踪，研究神经通路 。 （七）葡聚糖胺结合生物素 原 理 葡聚糖胺结合生物素(BDA) 被胞饮入神经元内，经轴突运输至一定部位，再用组化反应或荧光显微镜显示。 用 途 顺行追踪，研究神经通路 。 （八）病毒标记法 原 理 活病毒导入神经元，增殖，顺次进入各级神经元，用免疫组织化学显示。 病 毒 疱疹病毒（单纯疱疹病毒Ⅰ型、猪疱疹病毒） 弹状病毒 用 途 跨突触标记（顺向或逆向） 近年来，用分子生物学方法制作基因重组病毒。将绿色荧光蛋白（GFP）的基因整合入病毒，通过病毒增值，GFP在感染的神经元中表达。在荧光显微镜下观察GFP基因重组病毒在单个神经元范围内顺行或逆行标记，可显示神经元全貌，与Golgi法相似。 三、研究神经肽分布的方法 （一）黄递酶组织化学 原 理 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸-黄递酶（NADPH-d）是神经型一氧化氮合成酶(nNOS)的辅酶，两者高度共存。可将底物B- NADPH氧化成B- NADP，释放H2，使显色试剂硝基四氮唑蓝(NBT ）还原成DBT,黄色变成蓝色