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第五节 酶类药物的生产 一、药用酶的分类及应用 二、药用酶制备方法 三、药用酶的常用提取纯化方法 四、药用酶生产实例 五、药用酶的研究热点 一、药用酶的分类及应用 (一)、药用酶的概念 用于预防、治疗和诊断疾病的一类酶制剂称为药用酶。 (二) 药用酶的分类 1. 消化酶类 作用:水解和消化食物中的成分,用于治疗消化紊乱或促进消化。 如:胃蛋白酶、多酶片(蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纤维素酶)。 2、消炎酶类 作用:用于外伤、手术后、关节炎、副鼻窦炎等伴有水肿的炎症,能抑灭细菌,促进渗出液再吸收,达到消炎的目的。 如:蛋白酶(菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶);多糖水解酶(溶菌酶、葡聚糖酶);核酸酶;超氧化物歧化酶等。 (二) 药用酶的分类 3. 与治疗心脑血管疾病有关的酶类 作用: 血液中存在着相互拮抗的凝血系统和抗凝血系统(纤维蛋白溶解系统)。 如:链激酶、尿激酶和纤溶酶(临床上用于治疗血栓)。 4. 抗肿瘤的酶类 如:天冬酰胺酶(抗恶性肿瘤、抗白血病)、神经氨酸苷酶(肿瘤免疫治疗剂)。 (二) 药用酶的分类 5. 其他药用酶 解毒:有机磷解毒酶(用于治疗有机磷农药中毒,缓解中毒症状) 青霉素酶(能分解青霉素,用于治疗青霉素引起的过敏反应) 抗衰老、抗辐射:超氧化物歧化酶(清除体内氧自由基) 细胞色素C(是参与呼吸链的一种非常有效的电子传递体,是组织缺氧治疗的急救和辅助用药) 降血压、降血脂:弹性蛋白酶 防踽齿:葡聚糖酶 二、药用酶制备方法 (一) 酶的来源: 动物 植物 微生物 二、药用酶制备方法 (二) 药用酶制备方法 1. 直接提取法 工艺包括:选材→预处理→提取→分离→纯化。 关键:选择含量丰富的动植物原材料 重点:工艺简便、稳定、成本低、无污染、收率和酶比活力高、适于大规模生产的提取纯化方法。 2. 微生物发酵法 工艺包括:菌种培养→种子培养→发酵→发酵液处理 关键:选育高产菌株 高产菌株的选育途径:①自然界筛选,②诱变育种,③基因工程和细胞工程。 生产方法:液体深层发酵 提高药用酶产量的措施 3. 动植物细胞培养法 如:大蒜细胞进行培养来生产超氧化物歧化酶(SOD),利用木瓜细胞生产木瓜凝乳蛋白酶 三、药用酶的常用提取纯化方法 1. 水溶液法 ①盐浓度:稀盐溶液或缓冲液;一般使用等渗盐溶液,如0.002~0.005mol/L磷酸盐缓冲溶液或0.15mol/L氯化钠溶液。 ②温度:低温下操作; ③pH:选择偏离等电点的适当pH值。 三、药用酶的常用提取纯化方法 2. 有机溶剂法 【针对与脂类结合的酶,注意不可引起变性】 常用的有机溶剂:丁醇 方法:①均相法;②二相法。 3. 表面活性剂法 【一种解构蛋白质结合力的方法】 纯化方法参见蛋白质的纯化。 三、药用酶的常用提取纯化方法 4. 其他 利用溶解度、分子结构和大小、电离性质、生物功能专一性(亲合性)不同的纯化方法——盐析、凝胶层析、亲和层析、超速离心等。 四、药用酶生产实例——SOD 五、药用酶的研究热点 (一) 、酶分子改造 1. 药用酶的不足之处: 活力不高 稳定性较差:蛋白水解酶、抑制剂 有抗原性 体内半衰期短 2. 改造方法:酶分子修饰技术 通过各种方法使酶分子结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的过程 3. 酶分子修饰技术 金属离子置换修饰 用于酶分子修的金属离子是二价金属离子 大分子结合修饰 常用的修饰剂:右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸 肽链有限水解修饰 专一性较强的蛋白酶或肽酶 3. 酶分子修饰技术 酶蛋白侧链基团修饰 侧链基团 氨基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基 修饰剂 氨基修饰剂、羧基修饰剂、胍基修饰剂、巯基修饰剂、酚基修饰剂、分子内交联剂 五、药用酶的研究热点 3. 酶分子修饰技术 氨基酸置换修饰 物理修饰 副键发生某些变化和重排 (二) 基因工程药用酶的开发 * * 用于酶发酵生产的细胞必须具备的条件 产量高 易培养和管理 稳定性好 利于酶的分离纯化 安全可靠 常用的产酶微生物 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 黑曲霉 米曲霉 青霉 木霉 根霉 毛霉 链霉菌 啤酒酵母 假丝酵母 植物细胞 添加诱导物 酶的作用底物 反应产物 底物类似物 控制阻遏物的浓度 阻遏物: 酶催化反应产物 分解代谢物 采用较难利用的碳源、补料、分次流加碳源、添加环腺苷酸 代谢途径的末端产物 添加末端产物类似物 添加表面活性剂 非离子型表面活性剂 添加刺激剂 真菌细胞壁碎片或有效成分、微生物胞外酶、小分子物质 添加产酶促进剂 新鲜血液 红细胞 离
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