兽药检测技术 生物检定定量技术 9生物检定定量技术.ppt

生物检定定量技术 兽药检测技术 抗生素药物在低微浓度下即可对某些生物的生命活动有特异抑制作用，与化学药物相比，具有化学纯度较低、活性组分易发生变异、稳定性差等特点 。微生物检定法是在适宜的条件下，通过检测抗生素药物对微生物的抑制作用，计算抗生素效价的方法。该方法的测定原理能直接表示抗生素对微生物的作用，是其他物理学方法或化学方法所不能达到的，目前各国药典仍多数采用这一方法。依据设计原理不同，可分为稀释法、浊度法和琼脂扩散法。后二者被列为抗生素微生物检定的国际通用方法。《中国兽药典》首选方法是管碟法。 一、生物检定法概述 二、管碟法 兽药检测技术 当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低的自然梯度，即扩散的中心浓度高而边缘浓度低。在抗生素浓度高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。抗生素在一定浓度范围内，对数剂量与抑菌圈直径（或面积）呈线性关系。 1.原理 生物检定定量技术 二、管碟法 兽药检测技术 将未知效价供试液与已知效价的标准液，在同一条件下，抗生素在培养基内的扩散到达适当范围内产生了抑制试验菌生长的透明抑菌圈，经比较供试液和标准液两者产生的抑菌圈直径（面积）的大小，计算出供试品的效价。 2.方法 生物检定定量技术 二、管碟法 兽药检测技术 二剂量法是最常用的一种方法，系将供试品和标准品分别配制成高低两个浓度，高低浓度的比值（称为剂距）为2︰1或4︰1，在每个双碟内放置4个小钢管，对角的两个小钢管内分别滴装高浓度和低浓度的标准品溶液，其余两个小钢管分别滴装高浓度和低浓度的供试品溶液，在规定条件下培养后进行测定比较。 2.方法 生物检定定量技术 供试品效价相当于标示量或估计效价的百分数为： P为供试品效价（相当于标示量或估计效价的百分数）； S2为高浓度标准品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和； S1为低浓度标准品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和； T2为高浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和； T1为低浓度供试品溶液所致抑菌圈直径（或面积）总和； I为高浓度与低浓度比值的对数值（即剂距的对数值）。 兽药检测技术 生物检定定量技术 将此百分数乘以供试品估计的效价数，即得供试品每1mg中所含的单位数（U/mg）。 供试品的效价数（Pr）＝估计效价数（Ar）×P 本法计算所得效价，如低于估计效价的90％或高于估计效价的110％时，则应调整其估计效价，予以重试。 兽药检测技术 生物检定定量技术 （1）称量 （2）稀释 （3）双碟的制备 ①培养基底层的制备 ②培养基菌层的制备 （4）放置小钢管 （5）滴加抗生素溶液 （6）培养 （7）抑菌圈测量 （8）记录与数据处理 （9）结果判定 制备双碟 检定 步骤 配制抗生素溶液 生物检定定量技术 兽药检测技术 （1）称量 ☆标准品与供试品的称量均为一次取样称取 。 生物检定定量技术 兽药检测技术 二、管碟法 3.二剂量法步骤 生物检定定量技术 兽药检测技术 （2）稀释 ☆采用容量瓶 ☆取样量不得少于2ml ☆稀释步骤一般不超过3步 ☆从“0”刻度开始放溶液。 ☆标准品溶液取出须至室温后方可稀释 ☆剂距为2∶1或4∶1。 ☆平行原则 生物检定定量技术 兽药检测技术 ☆培养基均匀摊布 （3）双碟的制备 ☆台面必须水平 生物检定定量技术 兽药检测技术 ☆平稳落在培养基上 （4）放置小钢管 ☆小钢管经干热灭菌 生物检定定量技术 兽药检测技术 ☆滴加溶液的顺序为 SH→TH→SL→TL。 （5）滴加抗生素溶液 ☆成对角滴加标准品（S）及 供试品（T）高（H）、低（L） 两种浓度的溶液。 生物检定定量技术 兽药检测技术 （6）培养 生物检定定量技术 兽药检测技术 （7）抑菌圈测量 游标卡尺或抑菌圈测量仪 生物检定定量技术 兽药检测技术 （8）记录、数据处理 及结果判断 包括试验日期、称量时天平室温度、相对湿度，供试品的估计效价、标准品与供试品的称量、最终稀释浓度、稀释步骤，试验菌名、菌液浓度，培养基、缓冲液，抑菌圈测量结果、可信限率。