分离技术 色谱分离技术 第五章 色谱分离技术.ppt

* 点样 * （4）展开 纸色谱必须在密闭的层析缸中展开。在层析缸中加入适量的展开剂，将点好样的滤纸放入缸中。展开剂水平面应在点样纸以下，据不允许浸泡样品线。 展开剂的选择 欲分离物在两相中的溶解度；展开剂的极性；展开剂与欲分离物间应无化学反应；欲分离物在展开剂中的分配系数最好不受温度影响；欲分离物在两相间的分配平衡瞬间达到 * 按展开方法，纸色谱分为上行法、下行法、水平法 上行：慢（常用） 下行：快（适用于比移值小的溶质） * 展开操作 将滤纸浸于层析缸中的展开剂中，使展开剂通过滤纸的毛细作用上升（或下降），实现试样的分离 展开时必须在密闭的容器中进行 展开剂不得浸泡到点样线 展开次数 一元展开 二元展开（双向展开） 多段展开 * 双向纸色谱法 例：氨基酸混合液点在15*15cm滤纸边2cm处，风干，展开剂用CH3OH-H2O-吡啶（20:5:1），当溶剂移动至14cm处，取出风干。（第一次展开） 将滤纸折成筒状，使斑点处于下方，再用叔丁醇-甲基乙基酮-H2O-二乙胺（10:10：5：1）展开至14cm，取出风干。 （第二次展开） 显色：茚三酮-4-乙-2-甲氮苯-并HAc 第一次展开 第二次展开 * 纸色谱斑点拖尾现象有以下几种情况： 点样量过多，样品量超过了点样处滤纸所荷载的 溶剂能够溶解的能力 某些物质可以形成多个电离形式，且各自有不同 的Rf值，因而在纸上造成连续拖曳，这种情况可 使用碱性或酸性的展开系统，抑制其电离即可消除。 * 被分离的物质与滤纸上的Cu2+、 Ca2+、 Mg2+、等 杂质形式络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 某些物质在展开过程中会逐渐分解，如肾上腺素 和某些含硫氨基酸等，可将它们转变成稳定的物 质再作展开来克服 当被分离的物质能溶于显色剂中时，如显色剂用 量过多，可使斑点模糊或拖长。 * （5）显色及定位 有色物质，展开后即可直接观察各个色斑 紫外光照下产生荧光，观察荧光（例如生物碱） 喷以试剂使斑点显色（显色剂，碘蒸汽熏或氨水熏等） * 二、柱色谱分离 1、概念 利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同或其他亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附和分配等作用，从而将组分分开。 * 洗脱液 样品 填充物 分部收集 玻璃柱 * 色谱柱通常用玻璃柱。工业上大型色谱柱可以用金属制造。柱的入口端应该有进料分步器，使进入柱内的流动相分布均匀。有时也可在色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片或保持一段缓冲液层。柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板或玻璃细孔板支持固定相，最简单的也可以用铺有滤布的橡皮塞。 2、色谱柱的的分离与操作 （1）色谱柱的选择 * 设计柱长时需考虑下列几点： 柱越长，长度和内径比越大，就越难得到均匀的填装。大多数色谱柱的长度25cm左右。 柱的最小长度取决于所要达到的分离程度 较大的柱直径需要较长的色谱柱。 * （2）装柱 ①干法装柱 在柱下端加少许棉花或玻璃棉，再轻轻地撒上一层5mm厚的干净砂粒，或放置大小合适的玻璃砂芯。打开下口，然后将吸附剂经漏斗缓缓加入柱中，同时轻轻敲动色谱柱，使吸附剂松紧一致，最后，将色谱柱用最初洗脱剂小心沿壁加入，至刚好覆盖吸附剂顶端平面，关紧下口活塞。 * ②湿法装柱 先在吸附剂中加入合适量的色谱最初用洗脱剂调成稀糊状，再把放好棉花、沙子或合适大小的玻璃砂芯的色谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱子。注意整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂，最后让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂平面时，关紧下口活塞。 * ①湿法上样 把被分离的物质溶在少量色谱最初用的洗脱剂中，小心加在吸附剂上层，注意保持吸附剂上表面仍为一水平面，打开下口，待溶液面正好与吸附剂上表面一致时，在上面撒一层细砂，关紧柱活塞。 （3）上样 * ②干法上样 可选用一种对其溶解度大而且沸点低的溶剂，取尽可能少的溶剂将其溶解。在溶液中加入少量吸附剂，拌匀，挥干溶剂，研磨使之成松散均匀的粉末，轻轻撒在色谱柱吸附剂上面，再撒一层细砂。 * 在装好吸附剂的色谱柱中缓缓加入洗脱剂，进行梯度洗脱，各组分先后被洗出