蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法.doc

蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 实验目的 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术。 实验原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重复的方法。该法主要依据蛋白质的分子量对其进行分离。SDS与蛋白质的疏水部分相结合，破坏其折叠结构，并使其稳定地存在于一个广泛均一的溶液中。SDS-蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。SDS因易于操作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。 Acr和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸铵（Ap），催化剂十四甲基乙二胺（TEMED）；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的acr、bis、Ap、TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小、形状来选择凝胶浓度。 SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate）的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。 实验器材及数据 30%分离胶储存液、10%浓缩胶储存液、分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液、电泳缓冲液、样品溶解液、染色液、脱色液；标准蛋白，样品蛋白；电泳槽，移液管1ml，烧杯100ml 注意事项 acr和bis均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时应戴口罩和手套，纯化应在通风处内进行。 玻璃板表面应光滑洁净，否则在电泳时会在凝胶板与玻璃板之间产生气泡 因SDS可吸附考马斯亮蓝燃料，染色前先用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS。这可使染色及脱色时间缩短，并使蛋白带染色而背景不染色 实验步骤 安装垂直板电泳槽 将密封用硅胶框放在平玻璃板上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠。 用手将两块玻璃板夹住住放入电泳槽内，玻璃室凹面朝外，插入斜插板。 用蒸馏水试验封口处是否漏水。 制备凝胶板 分离胶制备：30%Air-Bis溶液2.5ml，Tris-HCL缓冲液（pH值为8.9）1.5ml，去离子水2ml，10%AP 60μl，TEMED 10μl，置于小烧杯中混匀。用移液枪吸取混合后的凝胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水（约3~4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸馏水，用滤纸吸去多余的水。 浓缩胶的制备：取Air-Bis溶液400μl，Tris-HCL缓冲液（pH值为6.7）750μl，去离子水0.9ml，10%AP 30μl，TEMED 7.5μl置于小烧杯中混匀。用移液枪吸取混合后的凝胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃上缘0.5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室，去掉密封用胶框，用1%电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加置内槽玻璃凹口以上，外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。 加样 用移液枪将一份2μl标准蛋白和3份5μl样品蛋白分别加入凝胶凹型样品槽底部，带所有凹型样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 电泳 将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电压调至80V。待样品进入分离胶时，将电压调至120V。当标准蛋白带分离得较清晰时，将电压跳回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在玻璃板一端切除一角以作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。 染色及脱色 将染色液倒入培养皿中，用微波炉加热20s，在摇床上放置2min，倒掉染色液，加入脱色液，在摇床上放置至能看清蛋白质带。 数据处理与记录 思考题 用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量时为什么要用巯基乙醇？ 答：保持蛋白质的二级结构.蛋白中如果有二硫键存在的话,会容易被氧化断开,使用巯基乙醇就可以免除这一隐患 是否所有的蛋白质都能用SDS-凝胶