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蛋白质双向电泳实验流程 一．样品制备 1.研磨 研磨时间要尽量短，并需及时补充液氮，研磨要充分，同时要保证损失少。 2.加入8mLTris饱和酚（pH8.8）和8mL抽提液，在通风橱内研磨30s。 先加8mLTris饱和酚，Tris饱和酚会变成固体，此时需用研磨碓将固体的Tris饱和酚研磨成小块。接着加入8mL抽提液，也需将固体的抽提液研磨成小块。等三者混匀后，将粉末转移至45 mL tube。 3.振荡30min。 室温静置，待tube中固体变成液体后，开始振荡。振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。 4.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45mL tub 酚相应该是绿色的，水相应该是淡黄色的。 5.取6mL的抽提液和6mL饱和酚加入水相，蜗旋振荡30min。 振荡需持续30min，每振荡1min，置于冰上冷却1min。 6.10000g，4℃，10min。将酚相（top phase）转移至45m 7.沉淀酚相。取一定体积（是酚相的5倍）的0.1M乙酸铵/甲醇溶液（–20℃保存）于酚相（45mL tube）。振荡30s，–20 8.清洗沉淀 ①15 min，20,000 g，4℃ ②加10mL 0.1 M乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30min。 ③15 min，20,000 g，4℃。 ④加入10 mL乙酸铵/甲醇溶液，用移液器吸打。–20℃沉淀30 ⑤15 min，20,000 g，4℃ ⑥加10mL 80%丙酮（ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 ⑦15 min，20,000 g，4℃。 ⑧加入10 mL 80%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 ⑨15 min，20,000 g，4℃ ⑩加入10 mL 100%丙酮(ice-cold)，用移液器吸打。–20℃沉淀30 min。 eq \o\ac(○,11)15 min，20,000 g，4℃。弃上清。 9.用药匙将离心管中的蛋白质样品取出，置于硫酸纸上，将样品制成粉末。 将粉末分装到2 mL的离心管中，每管装20 mg。用封口膜将离心管封口，做好标记，置于-20℃ 二．裂解 1.取出样品，加入样品20体积的裂解液. 这一步需要样品尽量浓，因此加入裂解液的体积要小。 2.置于冰盒，摇1.5h。 3.冰浴，超声15min。若有必要可再摇0.5h、超声15min。 4.35,000g 5 将上清转移至1.5mL tube中，取1μL进行定量，其余储于-20 6.进行定量 ①取样本液1μL和裂解液1μL于1.5mL tub中，加入500 μL Precipitant solution，震荡一下，室温下静置5 min。 ②迅速加入500 μL Coprecipitant solution，混合均匀。 ③20,000g 离心5 min。弃上清，再离心，弃上清。 ④沉淀加入100 μL Copper solution后，震荡一下，再加入400 μL ddH2O，将沉淀完全溶解。 ⑤快速加入1 mL Working color reagent，混合均匀后，室温静置20 min。 ⑥使用480 nm 波长测吸光值。 ⑦与蛋白质标准校曲线比较，计算出样本液的蛋白质含量。 三．第一相 1.依据定量的结果取样品于1.5 mL tube中，加再水化液于样品中（至总体积450μL），充分混匀。 2.35,000g，4 3.转移上清，准备上样 ①用移液器吸取样品溶液，将样品注入到胶条槽内 ②撕取胶条。手拿胶条的正极，用镊子将胶条表面的塑料片撕去（从正极端撕）。再用镊子夹住负极端，放入胶条槽中，字体朝上，有字端朝向胶条槽尖端。 ③.加覆盖油，盖上胶条槽的盖，将胶条槽放到IPGphor中。 4.进行IEF。 Prot# 4. 7 steps S1 30V 8:00Hr S2 50V 4:00Hr S3 100V 1:00Hr S4 300V 1:00Hr S5 500V 1:00Hr S6 1000V 1:00Hr S7 8000V 11:00Hr Number of strips 四．平衡 1.用镊子夹住胶条的负极（无字端），胶面朝左，背面朝右。背面贴着滤纸，吸干覆盖油。 2.取15mL（24cm）的SDS平衡缓冲液于管中，称取150 mg（100g/10mL）DTT。将试管置于摇床上，平衡15 min。（实验前配好） 3.DTT平衡完毕后，将试管中液体倒掉。用1×SDS Electrophoresis Buffer清洗胶条，清除附着在胶条表面的