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实验二十四 外周血单个核细胞的分离 (Separation of mononuclear cell in peripheral blood) 免疫细胞是一组不均一的细胞群体，它包括 T 、B 淋巴细胞、 NK细胞、单核细胞 / 巨噬细 胞以及粒细胞等，这些细胞的生物学特性，如细胞的大小、密度、表面电荷、黏附能力以及细胞 表面的分子标志等均存在差异， 借助这些差异可区分不同的细胞类别。 外周血单个核细胞 (PBMC) 的分离主要有两种方法，即聚蔗糖 - 泛影葡胺 (Ficoll-Hypaque) 分离法和聚乙烯吡咯烷酮硅胶 (Percoll) 分离法。此处只介绍聚蔗糖 - 泛影葡胺分离法。 【实验原理】 血液中单个核细胞的分离常采用密度梯度离心法。 市售淋巴细胞分离液是由聚蔗糖 (Ficoll) 和泛 影葡胺 (Hypaque) 按一定比例混合制成， 20℃密度为 1.077 ±0.001 ，单个核细胞包括淋巴细胞 和单核细胞，其密度为 1.050 ～ 1.077 ，而粒细胞和红细胞的密度为 1.080 ～ 1.110 。将待分离的 细胞悬液小心铺于淋巴细胞分离液上， 经离心后单个核细胞悬浮于分离液上层界面， 而红细胞与 粒细胞沉于管底。 【主要试剂和器材】 1. 聚蔗糖 - 泛影葡胺分层液 密度为 1.077 ±0.001 。 2.5g/L 台盼蓝。 , 3.250U/ml 肝素溶液 用 Hank s 液配制。 4.Hank , s 液。 5. 注射器、刻度离心管、吸管、滴管、血细胞计数板、载玻片、盖玻片。 6. 水平离心机、显微镜。 【操作方法】 1. 抽取静脉血 2ml ，注入含有 0.2ml 肝素溶液的无菌试管中摇匀，作白细胞计数和分类计数。再 , 加入等量 Hank s 液混匀。 2. 取 2ml 分层液置于离心管中， 将稀释血液沿管壁缓缓叠加于分层液上， 形成清晰界面。 稀释血 液与分层液的容积比例以 2 ∶1～3 ∶1 为宜 。 3. 置水平离心机中， 2000r/min 离心 20min 。 4. 离心后从离心管的底部到液面分为四层， 依次为红细胞和粒细胞层、 分层液层、 单个核细胞层、 血浆层 ( 含血小板和破碎细胞 ) 。 5. 用滴管直接吸出单个核细胞层，或吸去血浆层后再吸了该层，置于另一离心管中。 , 6. 加入 4 倍量以上的 Hank s 液，充分混匀， 1000r ／min 离心 l0min 。离心后倾弃上清液，再用 , Hank s 液洗 2 次。 , 7. 用含 10%～ 20%灭活小牛血清的 Hank s 液或培养液配制细胞悬液。计数，并分别计数粒细胞和 单个核细胞数，同时用台盼蓝检测细胞活力，最后按实验要求将细胞悬液调整到适当浓度。 【结果判断】