等电聚焦电泳（教学课件）.ppt

㈡引入电场时的变化 载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移，带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电荷被减少到零才停止。 ㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位置而给出一个pI梯度。 电解槽中，通电后，正负两极都会发生电 极反应： 正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e- 负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH- 在负极引起pH值的升高，在正极pH下降，另外在电极槽的正极端放的是酸性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了在电极附近pH的急剧变化。（图a） pH + - a 由于载体两性电解质是一系列不同分子的两性电解质的混合物所组成的，设其中某一成分为A，它的pI=pH’，当环境中的pHpH’时，它带负电荷，朝正极移动。(图b) pH + - b pH=pH’ A- 当环境pIpH’时，它带正电荷，朝负极移动，直至移动到它的等点电处，在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI处具有一定的缓冲能力，因此在它附近形成一个pH稳定区域。（图c） pH + - c pH=pH’ A+ 同样载体两性电解质中各种两性电解质也会各自迁移到它们的等电点处，由于它们的数量足够多，各自的等电点相差很小，从而形成一个pH梯度。（图d） pH + - d 假设在一个系统中含有极多的有适当的等电点和它的等电点处有一定的缓冲能力的两性电解质，因此形成的pH梯度将是连续平滑的。 pH梯度的选择 在测定未知蛋白时，可先采用pH3-10的载体，经初步测定后改用较窄的以提高分辨率。 （二）支持介质的选择 作用：防止扩散 抗对流 1.液体介质：蔗糖、Ficoll 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG （三）聚焦后的检测方法 * Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE 一、IEFE 定义 IEFE一种利用具有pH梯度的支持介质分离等点电不同的蛋白质的电泳技术。 各种蛋白质各自都有一个等电点,在一特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性,在电场中不会迁移。 等电聚焦就是在电泳介质中放入载体两性电解质，当通以直流电时，两性电解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质即移动到或聚焦于其相当的等电点位置上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中，电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电泳。 二、IEFE的特点 （一）优点 1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。 2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。 （二）缺点 1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。 2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。 分辨率较不连续PAGE更高，特别适合于分离分子量相同而电荷不同的生物大分子。 三、IEFE的基本原理 蛋白质分子在不同pH下的解离状态 NH3+ NH3+ NH2 P P P COOH COO- COO- pH＜pI pH＝pI pH＞ pI 在电泳介质中放入载体两性电解质，当通入直流电时，两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，正极附近是低pH区，负极附近是高pH区。 蛋白质分子的电聚焦过程 + pI1 pI2 pH=pI pI3