（教学课件）免疫学检测技术的基本原理.ppt

二、免疫细胞功能的测定 T细胞功能测定 B细胞功能测定 细胞因子检测 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 抗体含量测定 溶血空斑试验 巨噬细胞吞噬试验 细胞毒试验 吞噬功能测定 51Cr释放法 乳酸脱氢酶释放法 细胞染色法 凋亡细胞检测法 硝基蓝四氮唑试验 生物活性检测法 免疫学检测法 T细胞功能测定 T细胞增殖试验 迟发型超敏反应的检测 T细胞受到特异性抗原或有丝分裂原刺激后发生增殖，可通过以下三种方法检测： 形态计数法：活化细胞体积增大、形态不规则、胞质增多、细胞核松散及出现较多核仁； 3H-TdR或125I-UdR掺入法：3H-TdR能掺入到合成的DNA中，用液体闪烁仪检测样品的放射活性，特点是灵敏可靠，但须特殊仪器，易有放射性污染。 MTT (四甲基偶氮唑盐)比色法： 外来抗原刺激机体产生免疫应答后，再用相同的抗原作皮试，可导致迟发型超敏反应，T细胞活化并释放多种细胞因子，产生以单个核细胞浸润为主的炎症，局部发生充血渗出，24-48h发生，72h到达高峰。阳性反应表现为局部红肿和硬结，反应强烈的发生水肿甚至坏死。细胞免疫正常者出现阳性反应，细胞免疫低下者呈弱阳性或阴性反应。常用于检测某些微生物感染。 免疫学检测原理 免疫学检测是指借助免疫学、细胞生物学、分子生物学等理论或方法，对抗原、抗体、免疫细胞及细胞因子等进行定性、定量检测。临床医学中，免疫学检测可用于免疫相关疾病的诊断、病情检测和疗效评价等。 第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 第二节 免疫细胞检测 第三节 分子生物学技术在免疫学上的应用 本章内容 第一节 基于抗原-抗体反应的检测方法 一、抗原抗体反应概念 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。 二、抗原抗体反应的特点 高度特异性 可精确区分物质间极微细的差异。 表示为 亲和力：一个抗原表位与相应抗体单一抗原结合位点间的结合能力。 亲合力：指一个抗体分子与整个抗原大分子间的结合强度，与抗原表位数目有关。 2.抗原抗体结合的带现象与可见性 抗原抗体结合存在带现象（前带、等带、后带），适宜的抗原抗体浓度和比例（等带）决定抗原抗体结合后能否出现肉眼可见的反应； 3. 表面化学基团之间的可逆结合 抗原抗体结合除了空间结构互补外，主要以氢键、范德华力和疏水键等非共价结合。易受温度、酸碱度和离子强度的影响而解离，解离后抗原抗体仍具有原有特性，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。 抗原抗体反应的2个阶段 第1阶段是抗原抗体特异性结合，可在数秒钟至几分钟内完成；第2阶段是小的抗原抗体复合物靠正负电荷吸引形成较大复合物，所需时间从数分钟至数日不等。 三、抗原抗体反应的影响因素 电解质 抗原抗体等电点分别为pH3-5和pH5-6，在中性或弱碱性条件下表面带有较多负电荷，适当浓度的电解质会使它们失去一部分负电荷而相互结合； 温度 通常为37℃，适当提高反应温度可增加抗原与抗体分子的碰撞机会，但56℃以上可使抗原或抗体变性失活； 酸碱度 抗原抗体反应的最适pH值在6-8之间，pH值过高或过低均可直接影响抗原抗体的理化性质。当pH值接近等电点时，抗原抗体多带正负电荷相等，由于自身吸引而出现凝集，导致非特异性反应。 四、抗原抗体反应检测技术的应用 抗原与相应抗体在体内、外发生的高度特异性结合反应。在合适条件下所进行的体外反应中，抗原与相应抗体特异性结合可呈现某种反应现象（如凝集、沉淀）。由于实验所用抗体存在于血清中，故又称血清学反应。 五、抗原-抗体反应的基本检测方法 Ab Ag 高亲和力 Ab Ag 低亲和力 特异性 结合力的表示方法 亲和力和亲合力 低亲合力 高亲合力 Ag-Ab反应的原理 Ab 过剩 Ag 过剩 比例适当，交联成网络 Ag-Ab反应的可见性 1.凝集反应 直接凝集反应 1:2稀释待测血清 1:4 1:8 1:16 细菌、细胞等颗粒性Ag或表面包被抗原的颗粒状物质与相应Ab在电解质存在的情况下直接反应，二者比例合适时，出现肉眼可见的凝集团现象。 玻片法 试管法 常用于菌种鉴定或ABO血型鉴定 选择最佳稀释浓度，常用于检测抗体的滴度或效价，见于临床诊断伤寒或副伤寒所用的肥达氏反应和诊断布氏菌病所用的瑞特试验。 间接凝集反应 将可溶性Ag/Ab先吸附在某些颗粒载体上，形成致敏颗粒，然后再与相应Ab/Ag进行反应产生凝集，叫间接凝集反应。如将溶血毒素O吸附于乳胶颗粒上的抗“O”试