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荧光定量PCR
荧光定量PCR引物设计 （SYBR@Green ）
引物要求：
（1）设计的时候尽量靠近基因的3端，这样能最大限度地保证 增效率
（2 ）尽量跨越内含子，这样可以保证检测有无基因组污染
（3 ）两条引物的Tm值不要相差太大
（4 ）产物长度保证在80～200bp之间，最长300 bp 。
（5 ）避开保守区域
1. NCBI Primer blast
NCBI 设计引物网址： /tools/primer-blast/
Novobio Proprietary
Confidential
Primer blast 定义引物的范围
（举例：针对长3k的基因，若 增1000-1050的范围
，则可填入
输入基因号或FASTA序列 Forward – 1 to 1000, Reverse – 1050 to 3000
若有已知引物，可填
入，以测试特异性
针对sybr qPCR ：产物大小填
100 to 200 （最大不超过300 ）
可用默认值 （最佳Tm为60度，波动范围
Novobio Proprietary 57 to 63度，两条引物Tm差值小于3度）
Confidential
Primer blast
引物是否需跨不同Exon
选择1 - 无所谓
选择2 - 必须跨不同Exo
选择3 - 可以不跨Exo
勾 时表示两条引物之间必须包括一个以上的Intron （
当以基因组DNA为模板时）
Novobio Proprietary
Confidential
Primer blast
勾 时表示要检测引
物的特异性
填入要比较的物种 （
可输入通用名，如
human/mouse/rat/rab
bit
当需要同时比较多物
种时，点击”Add more
organisms”
勾 ”show results in a new window” 》点击”Get Primers”
Primer blast – 结果
2 beacon Designer 设计qPCR引物
专业的定量PCR设计软件：
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