基因工程载体质粒.pptxVIP

基 因 工 程 载体; 概 述; 载体; 目前的载体主要有： 1,质粒（Plasmid）载体2,入噬菌体3,柯斯质粒（Cosmid）4,M13噬菌体5,杂交质粒6,病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）。7,细菌人工染色体.(bacterial artificial chromosome，Shizuya，1992 BAC)8,酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，Merry，1983 YAC)9,来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome PAC, loannon，1994）、10,哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome，Farr，1991???11,人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome，Harrington,1997）12,植物人工染色体(PAC) ;质 粒 载 体（Plasmid） 一词最早是由Lederberg，1952年提出的。是双链、闭环DNA复制子（replicon）,存在于细菌的细胞质中并独立于染色体之外,能自主复制的一类DNA。 酵母的杀伤质粒（Killer Plasmid）是例外,它是一种RNA复制子。根据导链霉菌中存在 线状质粒 。质粒是细菌复制所非必须的，也就是说细菌失去质粒后仍可正常生长繁殖。但质粒可以赋于寄主某种新的有利的表型。 ; 质粒载体;质粒的一般生物学性质;PUC质粒都属松驰型质粒。 PACYC184等质粒属严紧型质粒。 根据需要使用严紧型还是松驰型质粒,如果插入外源DNA较大,或其产量过高会产生对宿主菌新陈代谢有干扰作用时，常选用严紧型质粒。反之选用松驰型质粒。 ;2. 质粒的不相容性(incompatibility);3. 质粒的转移性;非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用（mobiligation）又叫质粒的诱动。 ;带有大肠杆菌素基因的Col质粒和带有抗菌素抗性基因的R质粒既有属于接合型的，也有属于非接合型的。 如果在非接合型质粒的寄主细胞中同时存在一种接合型质粒，那么它们通常也是可以被转移的。这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程，叫质粒的迁移作用(mobilization)又叫质粒的诱动。ColE1是一种可以迁移但属于非接合型质粒。;2）F 因子;F因子是雄性决定因子，F+细胞表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结果，它促使F+经性须进入F-细胞。F-细胞则变为F+细胞。F因子可以通过接合作用自我转移，也能够带动寄主染色体一道转移。但F因子的这种整合过程是可逆的。在一定条件下，Hfr细胞又可重新变为F+或F-细胞。 基因工程多选用非接合型质粒，主要安全角度考虑 ;人工质粒要素;大肠杆菌质粒分子的结构示意图;质粒主要包括几个组成部分;pUC 18 和pUC 19质粒图谱;质粒主要包括几个组成部分： 一、复制子（reilcator） 也就是基础复制子（basic replicon），具有原质粒同样拷贝数的最小自主复制单位。一般约2kb，含一个复制起始部位Orgin（Ori）拷贝数多少和携带有控制复制的基因信息。; 复制起始位点(replication origin site) 是富 含A, T区,双链DNA在此 解鏈出现复制叉. 紧靠 富 A, T区的侧面富G,C区,组成回文结构,是 参与复制相关因子识别和结合位点.;具备有多克隆位点（Polylink）(MCS) 有数种限制性内切酶单一识别位点。便于插入外源DNA片段，易组建重组质粒而不影响质粒复制功能 ;有多用途的辅助序列 如加入不同启动子序列，用于生产单链DNA或RNA，外源基因的大量表达。又加入COS位点，使载体能容纳更大的DNA片段等等。 ;质粒载体的选择标记： 外源DNA片段与质粒载体DNA连接，再转化入宿主菌，经培养后需筛选鉴定转化子。这就需要利用质粒载体的可选择标记。 ; 质粒载体的选择标记;常用的是抗生素抗性基因的选择标记。主要有：四环素（Ter），氨苄青霉素（Amp），氯霉素（Cm），卡那霉素（Km）。新霉素（Neo）等。如质粒对氨苄青霉素有抗生时，则写成A