病理检验技术 （一）组织的特殊染色 酶类—碱性磷酸酶.pptx

病理检验技术特殊染色 酶类碱性磷酸酶酶类 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶( alkaline phosphatase)。此酶在碱性环境下催化醇或酚类磷酸酯的水解,它的最适pH为9.2~9.4。它被许多金属阳离子如镁、锰离子所激活,也可被某些氨基酸所激活。而氰化物、砷酸盐等则可抑制碱性磷酸酶。 碱性磷酸酶广泛存在于机体组织,常见于具有活跃转运功能的细胞膜内,如毛细血管及小动脉的内皮,肝细胞毛细胆管膜,肾近曲小管的刷毛缘,小肠上皮的纹状缘以及肾上腺等,是细胞膜的标志酶之一。碱性磷酸酶显示碱性磷酸酶常用方法有两类,一是金属沉淀的钙钴法,此法是 Gomori最先提出,以后有各种改良方法,另一是同时偶联法,此法也是Gomori利用a-萘基磷酸钠为底物与重盐偶联。随后 Burstone用萘酚AS-BI磷酸酯或萘酚AS-TR磷酸酯与六偶氢对品红偶联,以后又有多种的偶联改良法,钙钴法所需试剂较便宜易购,操作简便,但会出现假阳性,偶联法所需试剂难购价昂,但方法较灵敏,而且在正常组织内不存在茶酚,因此不会出现假阳性。 碱性磷酸酶 一、钙钴法（改良Gomori）(一)试剂配制1.2%的甘油磷酸钠2.2%的巴比妥钠3.2%的氯化钙4.2%的硫酸镁5.孵育液6.2%的硝酸钴7.1%的硫化铵即配即用,不能保存。 孵育液：2%的甘油磷酸钠 2.5ml、 2%的巴比妥钠2.5ml、 2%的氯化钙 4.5ml、 2%的硫酸镁 0.2ml、 蒸馏水0.3ml 依次混合后,pH应为9.4, 必要时可用0.1mol/L的盐酸或 lmol/L的巴比妥钠调整至PH9. 4 碱性磷酸酶-钙钴法（改良Gomori） (二)染色步骤1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳), 厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟后用冷丙酮固定10分钟。2. 切片浸入孵育液(预热至37℃)于37℃的恒温箱内孵育10~60分钟。3. 蒸馏水洗2次,每次1分钟。4. 2%的硝酸钴处理5分钟。5. 蒸馏水洗2次,每次1分钟。6. 1%的硫化铵处理1分钟。7. 流水冲洗5分钟。8. 常规脱水透明,中性树胶封固。 碱性磷酸酶-钙钴法（改良Gomori）（三）结果碱性磷酸酶活性处呈棕黑色。（四）对照方法1. 配制孵育液时,用等量蒸馏水代替2%的β-甘油磷酸钠，结果应为阴性。2. 将切片浸入80~90℃的热水中处理10分钟后再进行孵育,结果应为阴性。碱性磷酸酶-钙钴法（改良Gomori）(五)注意事项1.为了节约底物试剂,使用盖玻片(22mm×22mm)染色缸,容积为10m1,冷冻切片贴于盖玻片,一次可孵育4片。如用载玻片贴片和用载玻片染色缸孵育,则需配制30ml量孵育液,即用原法的3倍。2.配制碱性磷酸酶孵育液的各试剂可配成一定量用小瓶盛装,塞紧保存于4℃的冰箱可保存约半年,用前取出按比例混合,提前半小时置入37℃的恒温箱预热。3.1%的硫化铵配后不久会自行分解而失效,因此,每次要临时小量配制,一般取蒸馏水4ml加入硫化铵1滴充分混合即可。硫化铵用后要塞紧保存,否则容易挥发而失效。4.如需复染胞核,可在第7步脱水透明前把切片晾干,用1%的甲基绿复染10分钟即可。5.钙钴法对组织内的含铁血黄素与钙盐也可形成棕黑色沉淀,与碱性磷酸酶的阳性反应相似,容易混淆,必要时作铁反应和钙盐证明来鉴别。6.不纯的二甲苯对硫化钴有分解作用,导致阳性结果慢慢褪色,因此,用于最后透明的甲苯应选用AR级或以上级别。7.用于固定冷冻切片的冷丙酮一般放在低温恒冷切片机箱内。碱性磷酸酶-钙钴法（改良Gomori）(六)染色机制碱性磷酸酶在pH9.4的环境下,以镁离子为激活剂,把β-甘油磷酸钠水解出磷酸,磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙,磷酸钙再和硝酸钴作用形成磷酸钴,磷酸钴也是无色的,需用硫化铵处理变成棕黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。碱性磷酸酶二、a-萘基磷酸酯法(根据 Gomori)(一)试剂配制1. 5%的四硼酸钠2. 10%的硫酸镁3. 孵育液： a-萘基磷酸钠 2.5mg 蒸馏水 10ml 5%的四硼酸钠 0.8ml 10%的硫酸镁 1滴 固蓝B盐( fast blue b salt) 10mg 先把a-萘基磷酸钠溶于蒸馏水,然后顺序加入其余各试剂, 用玻璃棒搅动使溶解混合，过滤后立即使用。4. 1%的冰醋酸碱性磷酸酶（a-萘基磷酸酯法(根据 Gomori)）（二）染色步骤1.新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm, 贴于玻片,取出风扇吹干30分钟后用冷丙酮固定10分钟。2.浸入孵育液于室温孵育5~20分钟。3.流水冲洗2分钟。4.1%的冰醋酸浸洗1分钟。5.流水冲洗,再用蒸馏水洗3-5秒。6.甘油明胶封盖。碱性磷