病理检验技术 2.脂类染色法 脂质—胆固醇及胆固醇酯.pptx

病理检验技术;特殊染色 ;脂质 ;(一)试剂配制 1.2.5%的硫酸铁铵 2.冰醋酸硫酸混合液 冰醋酸 10ml 浓硫酸 10ml 于小滴瓶中倾入冰醋酸,瓶外放以冰块,然后慢慢加入浓硫酸,混合后数分钟即可取出，密封置冰箱保存备用。;(二)染色步骤 1.组织固定于10%的中性甲醛液中3天。 2.半导体制冷切片机切片,厚20μm(用低温恒冷切片机切片也可以,但组织经固定后切片比较困难),置入蒸水内浸洗3次,每次10分钟。 3.用玻璃钩把切片捞入25%的硫酸铁铵液内于室温作用7天,若置入37℃的温箱则作用3天。 4.取??切片,燕馏水洗2次,贴于载玻片上,抹去多余水分,风扇吹干。 5把醋酸硫酸混合液滴在切片正中(根据组织切片大小滴入2~4滴),加上盖玻片即可在镜下观察。;（三）结果 滴入混合液后,开始呈现红色或蓝色是无意义的,可以置之不理。通常在1分钟后出现绿色,即表有胆固醇和胆固醇酯存在,以后颜色逐渐加深。约半小时后,绿色逐渐消退而变为污褐色。 ;（四）注意事项 1.本法果用的冰醋酸和硫酸均需高纯度,如封盖后有大量气泡出现,则是酸液不够纯。 此试剂也易吸湿,应密塞置冰箱保存。 2.在操作中不能用手接触切片,因汗液含有胆固醇,可导致阳性反应。 3在滴入冰醋酸硫酸混合液后,要经常注意观察切片颜色的改变,此法反应较慢,半小切片呈污褐色即失去作用,切片不能保存,需拍片者就要在这半小时内拍片。 4.每批可取一张肾上腺皮质切片作阳性对照。;(五)染色机制 此方法是根据李伯曼-布查特反应改进而来,颜色反应原理尚不完全了解,一般认为切片先用硫酸铁铵氧化和媒染,再经冰醋酸硫酸脱水,聚合成绿色的色素,这种色素被认为是7-羟胆固醇。;(一)试剂配制 1. 60%的高氯酸(?perchloric?acid） 2. 高氯酸萘醌液： 1,2-萘醌-4-磺酸 10mg、、95%的乙醇5ml、60%的高氯酸2.5ml、浓甲醛 0.25ml、蒸馏水2.5ml 个先把95%的乙醇加入1,2-萘醌-4-磺酸,待完全溶解后,依次加入其余试剂,混合后应于当天能内使用。;（二）染色步骤 1.组织固定于10%的甲醛钙或10%的中性甲醛中2-3天。 2.半导体制冷切片机切片,厚20um(用低温恒冷切片机切片也可以,但组织经固定后比较困难),把切片移入10%的甲醛钙液中留置7天。 3.蒸馏水稍漂洗2次,裱贴于载玻片上,抹去多余水分,风扇吹干。 4在已干燥的切片上滴入高氯酸萘醌液,或用一支柔软的毛笔蘸适当的高氯酸萘醌液覆盖玻片,迅速加热至65~70℃(可用一铁板置于70℃的水浴箱内,铁板接近水面,将玻片在板上加热,也可放在70℃的干燥箱内加热),约1-5分钟,直到显色。在此期间,要加高氯酸茶液,保持切片足够湿润。 5.取出切片,不用水洗。 6.在盖玻片上滴入2-4滴60%的高氯酸,然后迅速将切片倒置向下对准盖玻片贴紧，即在镜下观察;(三)结果 胆固醇和胆固醇酯呈深蓝灰色或红色。 (四)注意事项 1.此法较硫酸铁铵法敏感和精确,组织不受损伤,出现的颜色可持续数小时。 2.冷冻切片后把切片捞入10%的甲醛钙中留置7天,目的是促进空气对胆固醇的氧化。 3.不要用甘油明胶作为封固剂,因甘油可使胆固醇呈阴性。 4.1,2-萘醌-4-磺酸可用1,2-萘醌-4-磺酸钠代替,其效果相同,钠盐更易溶于水,更难溶于乙醇,故可用蒸馏水5ml溶解;(五)染色机制 高氯酸作用于胆固醇和胆固醇酯,生成胆甾-3,5-二烯(?cholest-3,5?diene),后者与1,2-萘醌-4-磺酸结合,形成红色或深蓝灰色的复合物。由于颜色的不同,反映胆固醇的不同物理状态。蓝色的与结晶胆固醇有关,红色的代表分散的或液态胆固醇。 ;(六)应用 动脉粥样硬化病灶,肿瘤组织坏死灶内,细胞内类脂沉积,即韩-舒-克病(?hand-schills Christian?disease),脂性肾病的肾小管等可有胆固醇和胆固醇酯,如遇有细胞呈泡沫状面不明其化学性质时,可用此法证明。 肾上腺皮质中固醇类激素含量的增减也可用此法观察。