病理检验技术、教学服务模块 （一）组织的特殊染色、课件 酶类—细胞色素氧化酶.pptx

病理检验技术;特殊染色;酶类 ;细胞色素氧化酶;(一)试剂配制 1. 0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH7.4) 2. Weigert碘液：碘片 1g、碘化钾 2g、蒸馏水100ml，先把碘化钾溶于10ml蒸馏水, 溶解后再加入碘片,轻轻摇动数分钟使碘片完全溶解，再把余下的蒸馏水加入。 3. 5%的硫代硫酸钠 4. 10%的甲醛液 5. 10%的醋酸钴甲醛液：醋酸钴 1g、10%的甲醛液10ml 6. 孵育液：1-羟-2-萘甲酸 2mg、N-苯基-对-苯二胺 2mg、无水乙醇0.01ml、 0.05mol/L三羟甲基氨??甲烷/盐酸缓冲液(pH7.4)3ml、蒸馏水7ml， 先把上述两种试剂用无水乙醇溶解,然后加入缓冲液和蒸馏水,充分混合后过滤。;(二)染色步骤 1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟。 2. 切片浸入孵育液于室温孵育30~60分钟。 3. Weigert碘液处理2分钟。 4. 5%硫代硫酸钠处理3分钟。 5. 流水冲洗2分钟 6. 10%的醋酸钴甲醛液处理60分钟。 7. 流水冲洗5分钟。 8. 常规脱水透明,中性树胶封固。;(三)结果 细胞色素氧化酶活性部位为褐蓝色颗粒沉淀,只定位于线粒体内。 (四)对照方法 在孵育液内加入0.01mol/L氰化钾或叠氮化钠, 酶活性即受抑制,结果为阴性。 ;(五)注意事项 1. 孵育宜于室温(20~25℃)进行,若置于37℃的温箱孵育,虽可促进酶的反应,但同时也会促使靛酚的自然生成而影响结果。 2. 孵育后切片经 Weigert液处理,可增强和稳定反应的颜色。 5%的硫代硫酸钠使除去碘的背景着色。 3. 切片最后经醋酸钴甲醛液处理,钻盐与生成的有色物质螯合,甲醛则起固定作用,使切片不易褪色,10%的醋酸钴甲醛液应于使用当天小量配制。 4. 孵育时间因组织而异,心肌和肾孵育约20-30分钟,肝约50~-60分钟,甲状腺滤泡上皮需2小时左右。;(六)染色机制 细胞色素氧化酶是通过氧化细胞色素C间接氧化酚类和胺类,在有酶活性的地方生成一种有色的靛酚蓝而显示出来。 ;(一)试剂配制 1. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 2. 孵育液：3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐 5mg 0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4) 10ml 过氧化氢酶 1mg 细胞色素C 10mg 蔗糖 750mg 3. Mayer苏木精液(见“萘酚AS-TR磷酸酯法”);(二)染色步骤 1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟。 2. 切片浸入孵育液于室温孵育30~60分钟。 3. 蒸馏水稍洗3~5秒。 4. Mayer苏木精液浅染胞核2~3分钟。 5. 流水冲洗10分钟。 6. 常规脱水透明,中性树胶封固。;(三)结果 细胞色素氧化酶活性部位呈棕色颗粒沉淀,胞核染蓝色。 (四)对照方法 同 “苯基-对-苯二胺法”。;(五)注意事项 1.孵育液内加入过氧化氢酶,目的是除去切片内的过氧化氢,因为DAB除在细胞色素氧化酶存在下被氧化外,也能被组织内生成的过氧化氢氧化,造成人工假象。 2.孵育时间因组织而异,详见“苯基-对-苯二胺法”的注意事项。;(六)染色机制 细胞色素氧化酶催化3,3，二氨基联苯胺(DAB)使其侧链上的氨基氧化,进行反复的氧化性聚合和氧化性环化形成不溶性的棕色吩嗪聚合物,在孵育液中加入细胞色素C,其作用是加速反应产物的形成，增强颜色的深度,对酶活性较低的组织,还可加快其反应。 ;(七)应用 细胞色素是参与细胞内有氧代谢的一种主要的酶,细胞色素氧化酶的强弱反映细胞功能的变化,有大量线粒体的细胞,该酶活性较强,呼吸过程旺盛,因此,该酶活性可作为细胞有氧代谢程度的指标。 恶性肿瘤细胞大多数主要以无氧分解葡萄糖,最后产生乳酸,其呼吸功能较弱。所以,肿瘤细胞的细胞色素氧化酶活性都比其起源细胞明显下降。 例如原发性肝癌,转移性肝癌其细胞色素氧化酶活性只有正常肝脏的30%。