3T3L1细胞诱导分化.pdf

首先细胞数一定要够，接触抑制后，加诱导液，诱导液一（IBMX 是SIGMA 的，浓度我用0.5m mol/l,配的时候用 DMSO 浓缩 1000 倍，DEX 我用的是Solarbio 分装的100MG 的也用DMSO 溶，Ins 我用的人用胰岛素，医院买 的），最主要的是要细胞代数 20 代以内，换诱导液 2 时不用1ML 的移液枪加用200ul 的慢慢加. 让细胞长满以后，接触抑制 2 天（是细胞退出生长周期），加入含有 IBMX （一般使用浓度 0.5mmol/L ），DEX （地塞米松，一般使用浓度是1umol/L）和 insulin （胰岛素，一般使用浓 度1-10ug/ml）的培基2 天，再换成只含胰岛素的培基2 天，然后每两天换液（普通培基）。 这 是分化的步骤，但是最关键的是细胞的传代次数，我现在就在做诱导，细胞传代次数较 多，分化率很低。一般说不能超过20 代，最好在10 代以内。 诱导分化中，细胞的传代数和状态是最重要的。 诱导剂的配制 IBMX(异丁基- 甲基-黄嘌呤): 分子量：222.2 （Sigma:I5879 ）-20 度保存 用二甲基亚砜DMSO 配制111.1mg/ml （0.5mol/L ）储存液 终浓度为0.5mmol/L, 即每100ml 培养液加100ul 储存液。 DEX： 分子量：392.5 （Sigma:D4902）-20 度保存 用无水乙醇配制1mg/ml(2.5mmol/L)储存液 终浓度为1umol/L,即每100ml 培养液加40ul 储存液。可用2 年。 Insulin：分子量：6000 ,4 度保存 原液为诺和灵R：400IU/10ml 终浓度为10ug/ml,即每100ml 培养液加600ul 原液。4 度保存 3T3-L1 前脂肪细胞株的诱导分化 1) 将 3T3-L1 前脂肪细胞接种于培养板，用含 10%小牛血清的高糖 DMEM 培 液在37℃、5 ％CO 培养; 2 2) 待细胞长满至80-90%，融合2 天（融合的意思是指让细胞接触抑制，就是 长满后换液让其再长两天）后，加含终浓度为0.5mmol/L IBMX （储存液浓 度0.5mmol/L ）、终浓度为1umol/L(储存液浓度为 1mg/ml(2.5mmol/L))DEX 和终浓度为10ug/ml 的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM 培养48h ；（诱导 剂临用时再加到培液中混匀） 3) 48h 后换含终浓度为10ug/ml 的胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM 培养液 再培养48h ，48h 后再换 10%小牛血清高糖DMEM 继续培养，2 天后换培 养液一次，诱导分化8～12 天3T3-L1 细胞90%多呈成熟脂肪细胞表型，可 用于实验。 1 诱导操作注意事项： 1、一共需诱导3 次，每次诱导的时间点最好固定，保证诱导剂作用够48h ，若 时间冲突诱导的时间只可延长，不可短于48h 。 2、诱导操作需注意：以6 孔板为例，每孔3ml 培液，一个6 孔板需18ml 培液， 则第一次诱导时诱导剂的剂量分别是：IBMX18ul （储存液），DEX7.2ul 储存液， 胰岛素108ul （储存液）。第一遍诱导时用200ul 的移液枪先每孔加200ul 配制 好的诱导液，沿孔壁边缘来回横着划慢慢注下培液，动作一定要慢，不然细 胞会飘起来，俗称卷边。每孔加5 遍200ul 培液，合计1ml，第二、三遍则每 孔1000ul 加培液，方法同上，操作要慢、轻。 3、第2 次诱导时，诱导剂的配制为：18ml 培液，加胰岛素108ul （储存液），混 匀，操作步骤同前。第一次和第二次诱导很重要，动作一定要慢。第3 次诱 导诱导仅需换10%高糖DMEM 培液，但操作步骤同前，一般结果好的话第三 次诱导之前细胞内可见少量小脂滴，培液变黄，因为细胞里有脂滴了所以培 液看起来就黄了。 4 、第三次诱导以后，可见细胞内脂滴变大，但此时仍有细胞内的脂滴刚诱导出 来，需要两天后再次换液，此时换液则可每次1ml 的培液换，