生物制药工艺 基因工程制药技术 4.2.1基因工程制药技术.pptx

;目的基因的分离;;上游：主要指的是目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成。;将目的基因与载体连接后，转入受体细胞，即获得基因工程菌 该过程也称为基因工程的上游技术;特点： 只能合成小于100个碱基的特定序列 自动化程度高 合成速度较快;即反转录法。利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称为cDNA文库。;根据生物体内DNA复制原理，在DNA聚合酶催化下，以来DNA模板特异性扩增DNA。;载体是携带外源目的??因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因无性繁殖或表达有意义蛋白质所采用的DNA分子。 包括质粒载体、病毒（包括噬菌体）等。; 具有有效运载能力 载体自身能够独立复制，并能在宿主内进行自主性复制 必须有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上 必须带有标志基因，以便进行重组后的筛选;载体应具有启动子 载体应具有阻遏子，使启动子受到控制，因为外源基因的高效表达会抑制宿主细胞的生长、增殖，而阻遏子可是宿主细胞免受这种影响 应具有终止子，以便重点克隆外源基因区域，而不转录其他无关基因 所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，以便转录之后能够顺利进行翻译。;概念：指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。 特征：具有遗传传递和遗传交换的能力 进行独立复制，并随宿主细胞的分裂传递给后代 可编码自身蛋白质，对宿主生存无决定性影响;（1）复制子 又称复制起始区，包含控制质粒DNA复制起点和质粒拷贝数等遗传因素;抗生素抗性基因：氨苄青霉素，氯霉素，四环素、卡那霉素等。 含有抗生素抗性基因质粒质粒的宿主细胞能在含抗生素的环境中生长。;连接酶催化载体与目的基因DNA片段连接，形成重组子;通常采用转化的方法。转化是指细胞在一定的生理状态时可以获取外源遗传物质，导致宿主细胞某些遗传性状发生改变。;抗药性基因的检测（最常见） 基本原理 抗药性筛选法可区分重组子与非重组子 将外源DNA插入BamHⅠ位点： 重组子呈现 Apr、Tcs 非重组子呈现 Apr、Tcr ; 图 2;野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶分解X-gal成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝，从而使整个菌落变成蓝色。;未转化进质粒的菌不具有抗性——不生长； 转化了空载体??—长成蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌——长成白色菌落。;;