动物疫病 动物传染病的诊断 实验室分子生物学检测技术.ppt

(1)标本间交叉污染 (2)PCR试剂的污染 (3)PCR扩增产物污染。这是最主要最常见的污染问题。因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳就可形成假阳性。 污染原因 还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染加样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (4)实验室中克隆质粒的污染: 用克隆质粒做阳性对照的检验室这个问题也比较常见。 PCR整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区 扩增区 电泳区 严禁器材和试剂倒流！ 实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA 1.模板提取区这个区域专门用于制备模板提取核酸， ⑴PCR产物和带有待扩增序列的DNA克隆不能在这个区域操作。 ⑵用于样品处理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。 ⑶在提取DNA样品和RNA样品时要带手套，并要经常更换。 ⑷纯化样品对污染的风险有极大的影响。 ⑴所用的所有试剂盒耗材应该经DEPC处理，去除核酸和核酸酶； ⑵所用PCR试剂中的水都是高质量的新鲜蒸馏水； ⑶所用试剂都应大体积配制，分装保存（一次用量）； ⑷所用吸头和试管均为一次性并是灭菌过的。所用器皿和塑料制品都要严格消毒。 2.扩增区：PCR仪应单独放在另一间实验室。 3.电泳区：在这区域中所用的试剂，一次性器材和仪器都必须专门用于电泳，绝对不能把这一区域的试剂或仪器用于样品的制备，PCR反应前的操作。 染色液有毒，操作时应戴上手套，避光保存，较长时间不使用存放于4℃，以免挥发变干。 设置严格对照 阳性对照：阳性模板 阴性对照：阴性模板 空白对照：不添加模板 出现非特异性产物时应采取的措施 增加退火温度 减少TaqDNA聚合酶的浓度 减少退火及延伸时间 减少引物浓度 减少扩增循环次数 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近才出现的一种PCR检测方法，是基于荧光能量转移(FRET)的原理建立的。通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。 利用Taq酶的5 ‘ →3 ’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针。该探针可与DNA模板目的片段发生特异性杂交，探针的5 端标以荧光发射基团FAM（荧光发射峰值在518nm处），靠近3 端标以荧光淬灭基团TAMRA（荧光发射峰值在582nm处），探针的3端被磷酸化以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期Taq酶随引物延伸沿DNA模板移动，当移动到探针切断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。 特 点 　　FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性，而且由于荧光探针的应用，可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果，所以还具有DNA杂交的高特异性和光谱技术的高精确性，克服了常规PCR的许多缺点。FQ-PCR只须在加样时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，不需要PCR后处理，避免了常规PCR操作中的诸多弊端。 设计一对外测引物和一对内测引物 先用外测引物扩增含目的DNA的大片段 再用内测引物以扩增的大片段为模板扩增目的DNA片段 模板DNA 加外侧引物A和B 引物A 引物B PCR 加内侧引物C和D 引物C PCR 引物D 巢式PCR示意图 巢式PCR (nested primer PCR) 多重PCR (multiple PCR) 用多对引物扩增同一模板的几个区域。其结果是产生多个PCR产物，用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染。 三、应用：高致病性猪蓝耳病RT-PCR操作方法 组织样品：剪碎取0.05g研磨，加入1.5ml生理盐水匀浆，取上清100μl于1.5ml离心管中 全血样品：取血清100μl于1.5ml离心管中 阴阳对照：各取