dna提取实验步棸.pdf

（1）取新鲜或冰冻动物组织块0.5 g，尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入 5ml 的细 胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块。 （2 ）转入2ml 离心管中（转 2 管 或 4 管），每管转入 1ml，用台式离心机以 12000 rpm 离心 5min,弃上清收集沉淀。 （3 ）加入300ul 10×TE 缓冲液悬浮沉淀 （4 ）加入 100μl 200mg/ml 的溶菌酶，37℃水浴 1h； （4 ）加入50ul 10%SDS ,20μl 20mg/ml 蛋白酶 K 在 50℃恒温水浴锅中水浴 3h ,间歇振 荡数次。 （4 ）加入 100μl 5mol/L NaCl ，65℃水浴 10min （5 ）加等量（570ul ）的氯仿：异戊醇(24:1)振荡混匀，离心 12000 rpm，10min。 （6 ）.取上层溶液至另一管，加入等体积的酚：氯仿:异戊醇(25：24:1)，振荡混匀，离 心 12000 rpm，10min，取上层溶液至另一管，重复一次。 （7 ）加入2 倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀 20min ， 12000 rpm 离 心 ,10min 。小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。 （8 ）用 1ml 70%乙醇洗涤沉淀物 1 次，离心 12000 rpm ， 5min 。小心倒掉上清液， 将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁残余液滴除掉，室温干燥。 （11）加200ul 灭菌水重新溶解沉淀物。 （12）Nanophotometer 仪测定 DNA 浓度及 OD 值。 （13）-20℃保存备用。 1.3.2 菌群 16S rRNA 基因 V3 高变区 PCR 扩增 （1）16S rRNA 基因 V3 高变区通用引物： V3F ：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3’ V3R ： 5’- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3’ 其中，CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG G 为 GC 夹。 （2 ）反应体系（25 μl ）： gDNA 0.5 μl V3F 2.5 μl V3R 2.5 μl Taq buffer （Mg2+ free ） 2.5 μl MgCl2 2.5 μl dNTPs 0.5 μl Taq 酶 0.5 μl ddH O 13.5 μl 2 Total 25 μl 其中，所有样本 gDNA 在 PCR 扩增前均稀释到 40ng/ μl ，即每个反应体系中加入 gDNA 均为 20ng 。 （3 ）反应条件 首先采用 Touch-down 程序：94℃，3 min 预变性；94℃，1 min 变性； 65℃，1 min 退火；72℃， 1 min 延伸，之后每两个循环退火温度就下降 1℃，直到退火温 度降到 55℃，再以此为退火温度循环4 次；72℃，5 min 延伸；4 ℃，10min。随后通过对PCR 产物进行 Recon-condition PCR 去除嵌合体以及异源双链的影响：94℃，3 min 预变性；94℃， 1 min 变性；55℃，1 min 退火；72 ℃，1 min 延伸；共 6 个循环；7