氨基酸发酵生产技术 氨基酸菌种选育技术 学习手册（氨基酸发酵机制及菌种选育技术）.doc

天津现代职业技术学院 PAGE 1 学习手册 《子情境：氨基酸发酵机制及菌种选育技术》 引导文-单元设计-技能考核标准-实训指导书 子情境：引导文 氨基酸发酵机制及菌种选育技术 阅读材料 阅读材料 材料一、谷氨酸的发酵机制 一、 谷氨酸的生物合成途径 主要有：Glucose的酵解，EMP Glucose的有氧氧化，HMP 丙酮酸的有氧氧化，TCA循环 乙醛酸循环途径，DCA循环 CO2固定反应 α-酮戊二酸的还原氨基化 这6条途径之间是相互联系和相互制约的 材料二、GA生物合成的调节机制 一、优先合成与反馈调节 1、优先合成 1）优先合成（perference synthesis） a D→E A→B→C a酶活性远大于b酶活性 b F→G GA 比Asp优先合成，GA过量后，阻遏和抑制自身的合成途径，使代谢转向Asp 2、CO2固定反应的酶类受Asp的反馈抑制，GA 和Asp的反馈阻遏 3、α—KGA脱氢酶在GA生产菌中先天丧失或微弱 4、柠檬酸合成酶（TCA关键酶）：受能荷调节和GA的反馈阻遏和乌头酸的反馈抑制 5、GDH（谷氨酸脱氢酶）受GA的反馈抑制和阻遏 6、异柠檬酸脱氢酶：受α—KGA的反馈抑制。 异柠檬酸脱氢酶催化的异柠檬酸脱羧生成α—KGA和谷氨酸脱氢酶催化的α—KGA还原氨基话生成的GA的反应是一对氧化还原共轭反应，细胞内α—KGA和异柠檬酸的量需维持平衡，当α—KGA过量时对异柠檬酸脱氢酶发生抑制作用，停止合成α—KGA 由菌体的代谢可知，在正常情况下，GA并不积累。 二、GA生物合成的内在因素 从上图可以看出，菌体要在葡萄糖含量10%以上的培养基上，合成5%以上的谷氨酸，是一种不正常的现象，显然GA产生菌必须具备以下条件： 1.α—KGA脱氢酶酶活性微弱或丧失 这是菌体生成并积累α—KGA的关键，从上图可以看出，α—KGA是菌体进行TCA循环的中间性产物，很快在α—KGA脱氢酶的作用下氧化脱羧生成琥珀酸辅酶A，在正常的微生物体内他的浓度很低，也就是说，由α—KGA进行还原氨基化生成GA的可能性很少。只有当体内α—KGA脱氢酶活性很低时，TCA循环才能够停止，α—KGA才得以积累。 例：不要求生物素的一株丧失α—KGA脱氢酶的大肠杆菌突变株，分泌23.3g/LGA 2.GA产生菌体内的NADPH的在氧化能力欠缺或丧失 （1）如上图所示，NADPH是α—KGA还原氨基化生成GA必须物质，而且该还原氨基化所需要的NADPH是与柠檬酸氧化脱羧相偶联 的。 （2）由于NADPH的在氧化能力欠缺或丧失，使得体内的NADPH有一定的积累，NADPH对于抑制α—KGA的脱羧氧化有一定的意义。 3.产生菌体内必须有乙醛酸循环（DCA）的关键酶——异柠檬酸裂解酶。 该酶是一种调节酶，或称为别构酶，其活性可以通过某种方式进行调节，通过该酶酶活性的调节来实现DCA循环的封闭，DCA 循环的封闭是实现GA 发酵的首要条件。关于该酶的酶活性的调节后述。 4、.菌体有强烈的L—谷氨酸脱氢酶活性 思考一下：谷氨酸属于发酵工业产品类型中的哪种？A 微生物菌体 思考一下：谷氨酸属于发酵工业产品类型中的哪种？ A 微生物菌体 B微生物代谢产物 C微生物酶制剂 材料三：生物素对GA发酵的影响 GA 产生菌大都是生物素的营养缺陷型，即：VH-，在发酵过程中要严格控制其浓度，主要是生物素对发酵的影响是全面的，分述如下： 1.生物素对糖代谢的影响 一方面，VH对于糖酵解有促进作用，对丙酮酸的有氧氧化——乙酰辅酶A的生成也有促进作用，但两者的促进作用不一样，对前者大一些，这样培养基中如果有较丰富的VH，就会打破糖酵解与丙酮酸氧化之间的平衡，导致丙酮酸的积累，丙酮酸积累则可能导致乳酸的形成，乳酸声称，则使得碳源利用率降低，而且带来的是发酵液的pH值下降。 另一方面，可以通过控制VH的浓度，以实现对于乙醛酸循环的封闭。前述，封闭乙醛酸循环对于GA发酵的重要性，那么，如何封闭乙醛酸循环呢？ DCA循环的关键酶是异柠檬酸裂解酶，研究表明，该酶受以下几个因素的影响： 为醋酸诱导 受琥珀酸的阻遏，其活性受琥珀酸的抑制 （受到Glucose的阻遏？） 这样，当VH缺乏时： （1）丙酮酸的有氧氧化就会减弱(由于VH对TCA循环的促进作用)，则：乙酰辅酶A的生成量就会少，醋酸浓度降低，它的诱导作用降低； （2）VH对TCA循环的促进作用的降低，使得其中间产物琥珀酸的氧化速度降低，其浓度得到积累，这样它的阻遏和抑制作用加强； 两者综合的作用使得，异柠檬酸裂