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实验一 CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的： 学习从植物组织中 （幼叶）提取基因组DNA 的基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶 类 （尤其是氧化酶类），其对DNA 的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中 需加入抗氧化剂或强还原剂 （如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研 磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵) ，是一 种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（0.7mol/L NaCl ）是可溶的，通过有机溶剂抽提， 去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀 （CTAB能溶于乙醇）即可使核酸 分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料 中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（3-5g ）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加 入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h) 。 2 、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟， 之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2一次。 4 、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20 ℃冰 箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70% 乙醇中洗2-3 次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。 5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA （10mg/ml），37℃保温1h以除 去DNA 中的RNA 。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇 （24 ：1）轻轻上下颠倒10分钟后 10000rpm离心10分钟。 7 、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无 水乙醇，接着置于-20 ℃冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇， 1 加入70 ％乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500μl） TE 中。 8、待DNA完全溶解后进行1%琼脂糖凝胶电泳，检查DNA 的质量并据已知 的DNA 分子量标准估计其浓度。调整浓度后的DNA置于-20 ℃备用。 实验试剂： 1、1M Tris-HCL （pH8.0 ） 121.1g Tris溶于800ml无菌水中，加浓HCL调pH到8.0，定容至1L，高压灭菌。 2、0.5M EDTA （pH8.0 ） 186.1g EDTA-Na·2H O溶于800ml无菌水中，需用磁力搅拌器剧烈搅动，用 2 NaOH调pH值到8.0 （约20g ），定容至1L，高压灭菌。 3、3.5M NaCL 204.75g NaCL溶于1L无菌水中，高压灭菌。 4、10% CTAB溶液 10gCTAB溶于80ml无菌水中，定容至100mL，高压灭菌。 5 、DNA提取 3.5M NaCL 200ml 液（500ml ） Tris-HCL 50ml EDTA 50ml 10%CTAB 100ml Water 100ml 6、氯仿-异戊醇（24:1体积比） 7、RNAaseA 8、异丙醇 9、无水乙醇 10、3M醋酸钠 11、1×TE缓冲液 实验仪器： 液氮罐、1.5