微生物发酵技术 微生物发酵技术 6.2干扰素IFN-αⅡb的发酵生产.ppt

单元六 基因工程药物的发酵生产 项目一 基因工程药物的基本知识 项目二 干扰素IFN-αⅡb的发酵生产 项目三 乙型肝炎表面抗原的制备 一、α-干扰素的基本知识 干扰素是由诱导剂诱导人体细胞而产生的一类高活性多功能蛋白。干扰素被诱导合成和释放后，再作用于同种生物细胞，使其获得抗病毒和抗肿瘤等多方面的免疫力。 按照结构和来源方面的差异，可将干扰素分为3类，即α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素。 1.干扰素的作用 抑制病毒等细胞内生物的增殖 抗细胞增殖 免疫调节 增加组织相容性抗原表达 增加细胞对双链DNA的敏感性 在临床上，干扰素主要用于： 病毒性疾病 恶性肿瘤 用于病毒引起的良性肿瘤，控制疾病发展 基因工程IFN-αⅡb生产工艺流程 2.路线 1. 干扰素IFN-αⅡb基因工程菌的构建 二、干扰素IFN-αⅡb的发酵生产工艺 二、干扰素IFN-αⅡb的发酵生产工艺 2.发酵工艺控制 生产种子：人干扰素IFN-αⅡb的生产菌种用的是以大肠杆菌为宿主菌的基因工程菌。一般用温度敏感型启动子调控IFN-αⅡb的表达。 种子培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.5%NaCl，pH7.0，121℃灭菌15min。 种子摇瓶培养：在4个IL三角瓶中，分别装入250ml种子培养基，按要求灭菌后，分别接种人干扰素IFN-αⅡb基因工程菌，30℃摇床培养l0h，作为发酵罐种子使用。 发酵培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母抽提物、0.01% NH4Cl、0.05% NaCl、0.6% Na2HPO4、0.001% CaCl2、0.3% KH2PO4、0.01% MgSO4、0.4%葡萄糖、0.05%氨苄西林、少量消泡剂。添加氨苄西林的目的是防止污染杂菌。 发酵：用15L发酵罐进行发酵，发酵培养基的装量为10L，pH 6.8，搅拌转速500r/min，通风比为1:1m3/（m3·min），溶氧为50%。控制温度30℃发酵培养8h。 三、干扰素IFN-αⅡb的提取、精制 1.提取 干扰素发酵结束后，冷却，离心4000r/min，30min，除去上清液，收集湿菌体。 将湿菌体重新悬浮于5L 20mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）中，于冰浴条件下进行超声波破碎。 包涵体可用离心方法分离，离心条件为4 000r/min 30min，取沉淀部分，用1L含8mol/L尿素、20mmol/L磷酸缓冲液（pH7.0）、0.5mmol/L二巯基苏糖醇溶液，室温搅拌2h，使包涵体溶解。 三、干扰素IFN-αⅡb的提取、精制 1.提取 溶解后，再15 000r/min离心30min，去除不溶物（其中主要是细胞碎片），收集含有可溶性干扰素IFN–αⅡb的上清液，用20mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.0）稀释至尿素浓度为0.5mol/L，加二巯基苏糖醇至0.1mmol/L，4℃搅拌15h，15 000r/min离心30min，除去不溶物。 上清液经截留量为104相对分子质量的中空纤维超滤器浓缩，将浓缩的人干扰素IFN–αⅡb溶液经过葡萄糖凝胶柱（Sephadex G-50）分离。 2.纯化 将经Sephadex G-50柱分离的人干扰素IFN–αⅡb组分，再经DE-52柱（2cm×50cm）纯化，上柱后用含0.05mol/L、0.1mol/L、0.15mol/L NaCl的20mmol/L磷酸缓冲溶液（pH 7.0）分别洗涤，收集含人干扰素αⅡb的洗脱液。