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RU486诱导调控系统 一 RU486调控系统的结构 1RU486调控系统的基本结构 RU48硒控系统是1994年被 Wan膏[1] 提出的，它由嵌合调控子反式作用调控区和 目的基因区两部分组成。 反式作用调控区含 有任意启动子控制下的嵌合调控子，后者是 一种嵌合型的可诱导转录因子，它包括酵母 转录因子Gal4的DNA吉合区、单纯疱疹病 毒蛋白VP16激活区和PR-891突变体改良后 的C末端配体结合区三部分。 目的基因区是 指在最小启动子和四个 Gal4DNA结合区串联 体调控下的目的基因，如图1。 图1RU486调控系统的结构示意图 在GLVP中,Gal4DBD代替了孕酮受体的 DNA吉合区，从而避免了任何激活内源性孕 酮敏感性基因的可能，并且由于GAL4DB匪 哺乳动物细胞中不 存在，目前也没有发现任何哺乳动物的 靶基因可以被Gal4激活，所以这一调控子只 会调控目的基因的表达，而不会影响任何内 源基因［1］。PR-891是指野生型孕酮受体在 891位点平头切断造成的突变体,因此其不 能与孕酮受体激活剂 R5020结合,但却可以 与抗孕酮片RU486结合，从而在RU486存在 时激活孕酮受体介导的基因。这可能是由于 PR-891比野生型受体少42个氨基酸，而孕酮 结合位点属于缺失的下游内,RU486结合区 则位于上游位置［2］。这就避免了给予RU486 时，激活内源性孕酮受体诱导其它基因引起 一系列的细胞反应。并且由于反式作用调控 子是一种嵌合型的可诱导转录因子，所以它 不再与孕酮反应元件或糖皮质类固醇应答 成分结合［3］,干预孕酮受体介导的转录，取 而代之的是在RU486作用下,这一调控子仅 仅与目的基因区的 Gal4DBD结合,并激活目 的基因转录表达［2］。由于PRLBD-891的转 活能力较差，而VP16AD即VP16的C末端为 酸性,可以直接与转录起始复合物中的转录 因子TFI旧、TATA吉合蛋白和TBP辅助因子 TAFII40相互作用，具有很强的转活功能。 在目的基因区内，启动子有两种：胸腺 嚅嚏脱氧核昔激酶启动子和腺病毒 E1b基因 中仅仅包含TATA盒的最小启动子。Tsai[2] 等使用氯霉素乙酰转移酶作报告基因对二 者进行比较发现，p17x4-TATA-CAT比 p17x4-tk-CAT转染时CA侄础活力明显要低 一些；而给予RU486后，前者的CA暧能可达 大约50倍，后者仅有10~15倍。这可能是由 于tk启动子中含有G唇口 CAAT^等序列，从 而使转录效能较大。所以 TATA盒启动子结 构应用于要求目的基因的基础表达很低时 ， 而在基础活力稍高能够耐受，要求转录效能 很大时应使用tk启动子结构。对于 p17x4,Gal4DNA结合区的四个串联体则在这 一系统中可以提供最大的转录效能。 2RU486调控系统的结构改进 为了使RU48澜控系统将来能够应用于 人类的基因治疗，降低细胞毒性和免疫原 性,Mark等[4]1999年使用NFe B家族成 员——人的p65激活区替代VP16激活区，构 建出新的RU486反式作用调控区，以减少 VP16激活区可能带来的免疫反应。他们发现 使用TATA盒启动子启动目的基因时，在没有 RU486的情况下,GLP65的基础活力明显低于 GLVP给予RU486后两个调控子均表现出配 体剂量依赖性的目的基因表达,这时GLVP! 目的基因的表达更多，不过由于GLP65的基 础值很低，所以RU48湍予时，目的基因的表 达倍数会更高。tk做目的基因启动子时，上 述两种RU486系统则不管是否给予配体，两 者的作用相当。所以在使用 GLP65时，最好 选用TATA盒启动子作为目的基因的启动子。 另外,Mark等［4］在反式调控区与目的 基因区之间插入小鸡 6 -球蛋白5端区域 作为绝缘子将二者分隔，使目的基因在没有 RU486的情况下不受调控系统的调节而产生 表达。但是他们发现在活体大鼠模型 ，没有 RU486表达,有无绝缘子都不会有目的基因 的表达；但是HELAI田胞水平上，不含绝缘子 者的目的基因则会有较少的表达，而含绝缘 子者没有。 二RU486调控系统的激活 RU486调控系统的激活过程与笛体类激 素被其配体激活相似。反式作用调控子可以 在不同的组织定向启动子作用下，在各自靶 向的组织或细胞进行表达。当存在 RU486 时,RU486与PRLBD-891相结合，促使反式作 用调控子发生构象变化形成二聚体而激活 ， 激活的反式作用调控子与目的基因上游的 Gal4DNA吉合区四聚体结合，从而启动目的 基因的表达，如图2。反之，在没有RU486的 情况下，由于反式作用调控子的构象不会发 生变化，所以RU48碉控系统不能被激活，即 目的基因不能转录表达。这样,RU486调控系