现代分析技术与应用：第十一章 荧光分析法 (2).ppt

第十一章 荧光分析法 第一节 荧光分析法的基本原理 一、分子荧光 （一）分子荧光的产生 1. 分子的电子能级与激发过程 电子能级的多重性：M=2s+1 s为电子自旋量子数的代数和 A： B： C： 单重基态 激发 单重态 激发 三重态 E C A B ? ?? ? ? ? 用S表示 用S*表示 用T*表示 2. 荧光的产生 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量。 吸收 振动驰豫 荧光 内转换 外转换 磷光 体系间跨越 荧光发射——无论分子处于哪一个激发单线态，通过内转换及振动弛豫，均可返回到第一激发单线态最低能级，然后以辐射的形式发射光量子而返回到基态的任一能级。 磷光发射——经过体系间跨越的分子降至三线态最低能级，跃迁至基态而发生的光。 荧光的能量小于激发光能量（波长），由于电子返回基态时可以停留在基态的任一振动能级上，因此得到的荧光谱线有时呈现几个非常靠近的峰。荧光发射所需时间为10-9~10-7s。 特点：由于激发三重态的能级比激发单重态的能级要低，磷光的波长比荧光的波长更长，发光速度很慢， 10-4～100s。激发三重态电子易通过非辐射能量传递返回基态，因此室温下溶液很少呈现磷光。 （二）荧光的激发光谱和发射光谱 激发光谱：固定检测荧光的波长，扫描激发光波长?ex，记录对应的荧光强度F。F对?绘制曲线得激发光谱。 发射光谱（荧光光谱）：固定激发光波长，扫描检测荧光的波长?em，记录对应的荧光强度F。F对?绘制曲线得发射光谱。 λex λem 激发光源 样品池 荧光检测器 固定 扫描 单色器 单色器 溶液荧光通常具有的特征 1. Stokes位移： ?ex ?em 2. 发射光谱的形状与激发光波长无关。 3.通常发射光谱与激发光谱有镜像对称关系。 ?/nm 蒽的激发光谱和荧光光谱 200 250 300 350 400 450 500 F 二、荧光与分子结构的关系 （一）荧光寿命与荧光效率 荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间称荧光寿命，常用?f表示。 不同的物质可能有不同的荧光寿命，利用分子荧光寿命的差别，可以进行荧光物质混合物的分析。 荧光效率：是指激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比（在0~1之间）。 常用φ表示： 荧光效率（φf）= 发射荧光的光子数 吸收激发光的光子数 （二）有机化合物分子结构与荧光的关系 荧光物质的必要条件 A. 有强的紫外-可见吸收，即有共轭轨道π-π*，K带。 B. 具有一定的荧光量子产率。 1. 长的共轭结构 例 激发光 205nm 286nm 356nm 荧光 278nm 321nm 404nm 荧光效率 0.11 0.29 0.36 2. 分子的刚性和共平面性 荧光效率： 0.2 1.0 3. 取代基 1）能增加分子的?电子共轭程度，常使荧光效率提高： -NH2、-NHR、-NR2、-OH、-OCH3、-CN等。 2）减弱分子的?电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭： -COOH、-NO2、-NO、-C=O、-NHCOCH3、-SH、-F、-Cl、Br、I等 3）对分子的?电子共轭程度作用较小，对荧光影响不明显：-R、-SO3H、-NH3等。 + （三）荧光试剂 荧光试剂能与无荧光或弱荧光物质反应，生成具有较强荧光的产物，扩大荧光分析的应用范围。几个主要的荧光试剂： 荧光试剂 反应基团 ?ex ?em 荧光胺 伯胺 275，390nm 480nm 邻苯二甲醛 伯胺 400nm 455nm 丹酰氯 伯胺，仲胺，羟基 365nm 500nm 丹酰肼 羰基 365nm 500nm 无机离子荧光试剂 各种金属离子(Mn+) 三、影响荧光强度的外部因素 1. 温度：温度?，荧光强度