病理检验技术、教学服务模块 （一）组织的特殊染色、课件 酶类—r-谷氨酰转肽酶.pptx

病理检验技术;特殊染色;酶类 ;?-谷氨酰转肽酶 ;萘酰胺法(根据 Londa) (一)试剂配制 1. 1mol/L氢氧化钠 2. 底物溶液: γ-L谷氨酰-α-萘酰胺 2mg、二甲基甲酰胺 0.15ml、 lmol/L氢氧化钠0.15ml、蒸馏水4.7 ml，依次加入,充分 溶解混合,置于4℃的冰箱内可保存1周 3. 2mol/L盐酸 4. 4%的对品红盐酸液：对品红 1g、2mol/L盐酸 25ml、 充分溶解后于第2天过滤,置于4℃的冰箱约可保存使用1年 5. 4%的亚硝酸钠( sodium nitrite) 即配即用,不能保存。 ;6. 0. 1mol/l醋酸盐缓冲液(pH6.5) 7. 缓冲六偶氮对品红液： 4%的对品红盐酸液0.25ml、4%的亚硝酸钠液0.25ml、 0. 1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH6.5)8.5ml 取洁净烧杯一只,先滴入对品红盐酸液,然后慢慢滴入4% 亚硝酸钠液,边滴边充分摇匀,混合后放置2分钟,使充分偶 氮化,最后加入0.1mol/L醋酸盐缓冲液(pH6.5), 混合后用1mol/L氢氧化钠调至pH6.5。 8. 孵育液：底物溶液1ml、缓冲六偶氮对品红液 9ml、甘氨酰替甘氨酸 5mg 9. 2%的硫酸铜 10. Mayer苏木精液(见“萘酚AS-TR磷酸酯法”);(二)染色步骤 1. 新鲜组织低温恒冷切片(用液氮快速冷冻效果更佳),厚6μm,贴于玻片,取出风扇吹干30分钟后入冷丙酮固定10分钟。 2. 切片浸入孵育液于室温(20~25℃)孵育15~45分钟。 3. 蒸馏水洗。 4. 2%的硫酸铜处理5分钟。 5. 蒸馏水洗。 6. 10%的甲醛液固定1小时。 7. 流水冲洗5分钟。 8. Mayer苏木精液浅染胞核2~3分钟。 9. 流水冲洗10分钟。 10. 常规脱水透明,中性树胶封固。;(三)结果 酶活性部位呈棕色至棕黄色, 胞核呈蓝色。 (四)对照方法 1. 配孵育液时,用等量蒸馏水代替底物溶液,结果为阴性。 2. 在孵育液内加入0.001mol/L的硫酸铜,结果为阴性。;(五)注意事项 1. 甘氨酰替甘氨酸作为激活剂,有增强酶反应的强度,尤其适合于酶活性低的组织。 2. 底物γ--L谷氨酰-a-萘酰胺可用γ-L-谷氨酰-β-萘酰胺代替,但以前者更易溶解,水解也较快,定位好。 3. 本法以采用醋酸盐缓冲液为佳,如用其他缓冲液,可使酶活性减弱。 4. 谷氨酰转肽酶最适pH约为8.8,但因本法使用六偶氮对品红作偶联剂。使用六偶氮对品红作偶联,其pH不宜高于6.5,否则六偶氮对品红液容易发生降解而失效。;(六)染色机制 γ-L-谷氨酰-a-萘酰胺在γ-谷氨酰转肽酶的催化下生成γ-L谷氨酰-γ-L-谷氨酰-α--萘酰胺和a-萘胺,后者与六偶氮对品红偶联形成一种稳定的偶氮染料,该偶氮染料再与铜离子整合形成棕黄色的复合物在酶活性部位显色。 甘氨酰替甘氨酸的作用是提高γ-谷氨酰转肽酶的活性。;(七)应用 在胎儿和刚出生的新生儿,其肝细胞中的γ-谷氨酰转肽酶活性很高,但在出生后即迅速降低。 在成年人正常肝,γ-谷氨酰转肽酶活性仅见于胆管上皮细胞,正常肝细胞则为阴性。 但在变异肝细胞灶和肝癌细胞中该酶大量出现。 因此,此酶可作为癌前和肝癌细胞的标志酶,无论在原发性部位或转移灶,均呈阳性反应。