药剂学：蛋白质多肽类药物结构修饰.ppt

3. 常用的聚乙二醇衍生物  mPEG-MAL (mPEG-马来酰亚胺） 马来酰亚胺和巯基的偶合是蛋白和多肽偶联中的一个非常有用的反应。 这个反应很特别，即使在其它功能基存在下，它也可以在温和的条件下进行。 作为有活性端基的聚合物，mPEG-MAL已被用来合成具有确定结构和生物活性的PEG-蛋白质偶合物。mPEG-MAL也常用作聚合物试剂来选择性诱捕含巯基的多肽。 第二代聚乙二醇  聚乙二醇(PEG)分子活化的方法。(1)三氯- s - 三嗪(氰尿酰氯)法；(2) 修改的氰尿 酰氯法; (3a)PEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯法；(3b)戊二酸酯置换琥珀酸酯残基法；(3c) 3a中脂肪族酯用酰胺键置换法；(4) 咪唑甲酸酯法；(5)和(6)是利用PEG苯碳酸酯的 改变方法；(7) PEG的琥珀酰亚胺碳酸酯；(8)PEG的琥珀酰亚胺活化酯 4. PEG修饰过程设计 影响PEG修饰过程的主要因素： 蛋白质浓度，蛋白质与PEG修饰剂质量的比，反应的pH和离子强度，反应温度，反应持续时间等。 （1）液相反应： 蛋白质与PEG的摩尔比一般为1:3-5，反应pH在7-8，温度保持在8-16小时，使用冰醋酸调节pH4.5终止反应。反应混和物用水稀释后在阳离子交换柱上进行吸附分离，除去剩余的PEG和反应副产物。修饰蛋白与未修饰蛋白可以通过提高缓冲液中盐的浓度来分离。 液相反应 液相反应实例： 天花粉蛋白的定点PEG修饰 在TCS蛋白中引入一个半胱氨酸残基，然后使用马来酰亚胺-PEG与半胱氨酸上的巯基反应，得到PEG化的TCS。 （2）固相反应 蛋白质预先吸附到离子交换柱上，在规定时间内用PEG修饰剂循环流过柱子。反应结束后，将过量的PEG和其他副产物洗掉。改变缓冲液盐的浓度，将修饰蛋白质洗脱下来。柱子可以再生使用多次。 5. PEG修饰的方法及生物优化 蛋白质或多肽上的反应性官能团的亲核活性，巯基 α -氨基 ε -氨基羧基羟基。 巯基通常存在于蛋白质的二硫键和活性位点上。现在一般修饰在分子表面赖氨酸残基上的α –氨基和 ε -氨基。 （1）氨基的修饰 蛋白质分子表面的氨基主要为Lys的ε -氨基及N末端的氨基。 早期氨基修饰的PEG用氰脲酰氯法，现在常使用烷基化PEGs和酰基化PEGs A 烷基化PEGs对氨基的修饰 包括PEG-醛，PEG-三氟乙磺酸，PEG-环氧化物 前两者较常用。 B 酰基化PEGs对氨基的修饰 包括PEG-琥珀酸亚胺酯， PEG-对硝基苯碳酸酯， PEG-三氯苯碳酸酯， PEG-苯并三唑碳酸酯， PEG-氧羰基咪唑。 PEG-琥珀酸亚胺法常见，如SS-PEG，SPA-PEG，SC-PEG等。 （2）羧基的修饰 羧基的修饰位点包括天冬氨酸，谷氨酸及末端羧基。 一般在二环己基碳二亚胺(DCCI)或者1-乙基-3-二甲氨基丙基-碳二亚胺盐酸盐（EDC）存在下，羧基可以与氨基PEG结合 （3）巯基的修饰 对活性影响较小，游离状态的巯基进行修饰。 常用的有PEG-马来酰亚胺， PEG-邻-吡啶-二硫醚， PEG-乙烯基砜， PEG-碘乙酰胺等 蛋白质PEG化的条件  PEG和蛋白质偶合的反应条件取决于所用的蛋白质、所要求的PEG化程度和所使用的PEG衍生物。选择何种PEG衍生物和所用的蛋白偶合，需要综合考虑如下的因素： 1.所要求的结合点； 2. PEG衍生物的水解稳定性和反应活性； 3.和蛋白连接的稳定性； 4.对产物能够进行适当的分析。 6. PEG修饰蛋白质多肽类药物的分析方法 PEG修饰药物的分析内容包括：药物的平均修饰度， PEG修饰的特定位点及特定位点的修饰程度，偶联不同个数PEG药物的相对含量。 蛋白质或多肽的平均修饰度，即每个偶合物上平均偶联有多少个修饰剂分子。测定常用荧光光度法和分光光度法。 短肽的PEG修饰的位点的辨识可以进行Edman降解法分析，但分子量大的蛋白修饰位点的识别很困难。 偶联不同个数的修饰剂的偶合物的相对含量可以通过凝胶过滤色谱，毛细管电泳，或质谱等检测。 7. 现有的PEG修饰蛋白质多肽类药物概况 （1）腺苷脱氨酶(ADA) 第一种上市的PEG修饰药物,1991年上市。用于治疗严重的综合性免疫缺陷症（SCID）。PEG-ADA的半衰期显著延长，疗效较好，并且患者耐受性好，没有过敏反应。 （2）天冬酰胺酶 L-天冬酰胺酶可以催化L-天冬酰胺水解为天冬氨酸，其与其他化疗药物结合是治疗白血病的一种有效手段。 L-天冬酰胺酶是大肠杆菌表达产物，重复注射产生较强的免疫原性，PEG-天冬酰胺酶1994年上市，用于治疗急性淋巴性白血病和恶性黑色素瘤。 7. 现有的PEG修饰蛋白质多肽类药物概况 （3）粒细胞集落刺激因子(G-CSF)