SNP开发验证的研究应用方法和关键技术路线.doc

SNP开发/验证研究方法和技术路线 1分子标识： 分子标识，我想这部分是我们分子标识组最关键任务。现在，我们没有任何可用标识检测我们定位材料。即使想要验证已经定位QTLs，我们也需要相对应区间内分子标识，尤其是SNP标识。 1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片： 一套完整全基因组SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。能够直接对定位群体进行初定位扫描或是对育种材料背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3kIllumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常能够用来QTLs初定位，育种材料群体划分和纯度判定和低密度关联分析等。在此，我提议我们应该开发一套番茄基因型检测芯片。 现在，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix企业现在并没有对应产品。不过经过跟Affymetrix企业了解，能够利用Illumina芯片已经有结果进行开发。 番茄现在测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，不过她们包含基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD衰减值应该更大，有效历史重组会更少，遗传多样性低。所以，综合考虑，我提议我们能够开发~3k芯片，应该能够满足大多数研究材料、育种材料基因型检测需求。即使现在下一代测序技术蓬勃发展，不过对于用于基因型检测来讲，其数据分析和成本相对于芯片全部要更复杂和更高。总而言之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高应用价值。即使像玉米，这么测序技术发展很多年材料，芯片技术也在应用。 1.2全基因组SNP—Douglas： 当用Affymetrix芯片检测判定完番茄基因型并完成基因型分析以后，1）对于优良QTLs或是基因，我们能够直接选择覆盖整个区间分子标识运行Douglas系统进行分子标识辅助育种，2）对于需要深入验证QTLs，我们也能够利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其它方法进行全基因检测（图1.1）。3）对于部分高信息量，均匀分布在全基因SNP分子标识，能够用来构建番茄指纹图谱。所以，一套完整能够和Affymetrix芯片相对应SNP标识是必不可少。 图1.1 QTL区间上SNP标识分布图 注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。 1.3 Douglas系统下SNP标识开发 经过建立稳定、可靠番茄DNA提取步骤和优化PCR反应体系，筛选含有一致性、稳定性和多态性SNP分子标识引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标识。全基因组SNP分子标识，能够用于番茄QTL定位群体检测，分子标识辅助育种选择和全基因组选择群体基因型检测。同时，从中挑选高质量，高信息量分子标识用于构建一套完成番茄指纹图谱，检测品种一致性。 1.3.1 供试材料： 22份材料DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（None Template Control），累计24份模板作为SNP引物早期筛选。以上试验在Q6仪器上进行。 对于筛选择得一致性引物，在利用94株番茄自交系和2份水作为模板，深入在Douglas仪器上验证。 1.3.2 DNA提取： 1. 取~10mg 植物组织，加入研磨介质和400μl 裂解液，研磨5min，3000g离心5min。 2. 加入裂解液1/3 体积提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g 离心10min，吸收上清300~400μl 加入到样品板中。 3. 根据下表在各96 孔板中加入试剂： 板号 板型 板名 成份 样品及试剂体积 1 Microtiter deep well 96plate 样品板（Lysis） 样品反应液 无水乙醇 300~400μl 400μl 2 Microtiter deep well 96plate 洗涤板I（W1） PW 磁珠 800μl 30μl 3 Microtiter deep well 96plate 洗涤板II（W2） 80%乙醇 磁套 800μl 4 KingFisher 96 KF plate 洗脱板（Elution） TE1.0 50~100μl 4. 将各96 孔板按仪器提醒次序放入仪器中，运行程序。 5. 程序运行结束后，将DNA 溶液转移PCR 板中并测量浓度（100ng/μl），进行后续试验或于-20℃保留待用。 1.3.3 分子标识命名： 分子标识全部采取统一命名规则，这么有利于结果修改和维护。比如： 名称 ID SNP位点 正向引物 反向引物 模板序列 SolBeckman-00001-V1 Sol00001 A/G 引物合成：由上海生工企业负责引物合成。 1.3.4 S