抗菌药物最小抑菌浓度的测定.docVIP

抗菌药物最小抑菌浓度的测定 一、概念：最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）：在特定环境下孵育24小时，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度即最小抑菌浓度，用于定量测定体外抗菌活性。 二、实验目的：通过采用常量稀释法, 检测几种抗菌药物对----菌株的最小抑菌浓度( MIC) , 对临床诊断用药有指导作用。 三、仪器和试剂： MH液体培养基 无菌试管 分光光度计 0.5麦氏标准比浊管 MH琼脂 微量加样器 蒸馏水 吸头 0.1mol磷酸缓冲液（PH6.0） 接种环 无菌生理盐水 无菌平板 无菌滤膜0.22 无菌针筒 金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 抗菌药物 四、检验方法：液体稀释法、琼脂稀释法、E试验（E test） 液体稀释法操作步骤： 抗菌药物原液配置 抗菌药物原液配置 MH液体试管中抗菌药物梯度稀释 待测菌和质控标准菌 观察结果 1..抗菌药物原液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。 所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表1。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-20℃环境，并注意抗菌药物的保存期限。 表1 稀释法中常用的抗菌药物容积稀释法 药物浓度 （ug/ml） 取药液量 （ml） 加稀释剂量 （ml） 药物稀释浓度 （ug/ml） 琼脂或肉汤中最后含药浓度（ug/ml） 药物：琼脂（或肉汤）=1：9 5120512051201280128012801601601602020202.52.52.5 111111111111111 013137137137137 5120256012806403201608040201052.51.250.60.3 51225612864321684210.50.250.1250.060.03 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 3.培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 4.接种物的制备 有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。另外设对照3支，别为肉汤对照、质控菌对照和待测菌生长对照。 6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血