酶提取方式与纯化要求.ppt

酶的提取方式和纯化要求; 1 酶液获得 2 沉淀、萃取方法 3 柱层析分离法 4 电泳;防止酶的变性失活 低温 合适的pH 避免激烈搅拌，减少泡沫 去除重金属、微生物、蛋白酶等 ;一、酶液的制备;2、微生物胞外酶的酶液制备流程;3、细胞破壁的方法：;4、发酵液的预处理 ;5、固液分离 过滤 离心 沉降 膜过滤;6，酶液浓缩 酶液浓缩的作用 减少盐析剂、有机溶剂用量 减少压滤后的废水量，从而减轻其对周围环境的污染 酶液浓缩的方法 真空浓缩（刮板薄膜蒸发器、降膜式蒸发器、升膜式蒸发器） 冰冻浓缩 超滤浓缩;盐析沉淀 有机溶剂沉淀 等电点沉淀 复合沉淀 双水相萃取 反相胶团萃取;1，盐析;■ 提高盐浓度会增加蛋白质的溶解度：;分子在其等电点时，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入盐离子会破坏这些吸引力，使分子散开，溶入水中。;蛋白质分子表面的疏水性区域，都聚集许多水分子，当盐类加入时，这些水分子被抽出，以便盐离子进行水合，暴露出来的疏水性区域相互结合，形成沉淀。;机 理 破坏酶蛋白质分子表面水膜 中和酶蛋白质分子表面电荷;盐析法的优点 成本低，不需要什么特别昂贵的设备。 操作简单，安全。 对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析法的缺点 沉淀物中含有大量的盐析剂;盐析用中性盐的选择;常用的中性盐中最重要的是(NH4)2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类：;2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的(NH4)2SO4保存可达数年之久。 4) 价格便宜。;盐析剂用量的确定;盐浓度的表示法;影响盐析的因素;蛋白质的浓度与盐析的关系;离子强度和类型对盐析的影响;pH对盐析的影响;温度对盐析的影响;2，有机溶剂沉淀;优 点 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只有在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 沉淀不用脱盐，过滤比较容易。 在生化制备中应用比盐析法广泛;常用的有机溶剂;有机溶剂的选择 ;有机溶剂添加量的确定;有机溶剂沉淀的影响因素;温度对有机溶剂沉淀的影响;酶蛋白浓度对有机溶剂沉淀的影响;pH值对有机溶剂沉淀的影响;金属离子对有机溶剂沉淀的影响;离子强度对有机溶剂沉淀的影响;3，等电沉淀;等 电 点;等电点沉淀法主要利用酶蛋白分子上的电中性时溶解度最低，而各种酶蛋白具有不同等电点而进行分离的一种方法。 酶在处于等电点时的pH值，再加上其他沉淀因素，则很易沉淀析出。;等电点沉淀法一般适用于疏水性较大的酶蛋白，而对于亲水性很强的酶蛋白，由于在水中溶解度较大，在等电点的pH下不易产生沉淀。所以，等电点沉淀法不如盐析沉淀法应用广泛。但该法仍不失为有效的蛋白质初级分离手段。 与盐析法相比，等电点沉淀的优点是无需后继的脱盐操作。但是，如果沉淀操作的pH过低。容易引起酶蛋白的变性。 ;在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，分离出沉淀后，再用适当的方法将酶从复合物中重新析出。;5，双水相萃取;6，反相胶团萃取;7，色谱柱分离;第二节 酶的剂型与保存;2、固体剂型 直接浓缩干燥、喷雾干燥、沉淀后干燥； 便于运输和短期保存，成本也不高。;3、纯酶制剂 包括结晶酶在内，一般用作分析测试试剂或用作药物，要求有较高纯度。 4、固定化酶制剂;二、酶的稳定性与保存