临床基因组学：第四章 荧光原位杂交技术.ppt

重复DNA序列探针 重复DNA序列、多基因家族作为探针与染色体原位杂交。容易产生较高的分辨率。因为这些DNA多拷则序列在染色体上可达几十个kb或几个Mb。日前所使用的这类探针有45S rDNA,5S rDNA、着丝点序列、端粒 序列、亚端粒序列、转座子等。 单拷贝或低拷贝DNA探针 这类探针包括某个基因的DNA克隆. RFLP或RAPD标记。这些探针DNA序列一般只有1-2kb.因而这类标记的原位杂交存在几个方面的困难: 1)需要用多层抗体结合来放大杂交信号 2)杂交信号很弱时.难以与背景信号区分 3)能够显示杂交信号的细胞比例很低 基因组DNA探针 利用不同基因组DNA同源性程度的差异。在原位杂交中只标记某一基因组或某个物种的基因组DNA。 在杂交中标记的基因组DNA首先与其完全同源的DNA杂交。 可以检测出导入异源多倍体的外源染色体或染色体片段，同时可以清楚地显示出易位与交换的位置。 1．重复序列探针 (1)着丝粒探针 此类探针的杂交靶常大于1Mb，探针与靶DNA结合紧密，杂交信号强，易于检测。主要用于检测染色体的数目，鉴定单体、三体、多体、多倍体以及标志染色体等染色体异常。 按染色体上位置分类探针 (2)异染色质探针 人类1，6，9，16号染色体着丝粒附近及Y染色体长臂含有明显的异染色质区，异染色质探针除了可代替着丝粒探针用于检测染色体数目异常外，还可用于分析涉及这些异染色质区的染色体结构改变。 (3)端粒探针 人体染色体长、短臂末端均有简单重复序列组成的端粒结构，端粒探针主要用于确定染色体数目、末端缺失和染色体易位等。 2．涂染探针 染色体涂染探针的杂交靶或为整条染色体，或为染色体的单臂，也可以是染色体的特定区带。这类探针在鉴定标志染色体的来源、染色体易位等方面效果较好。其最重要的应用是对常规细胞遗传学显带方法难以鉴定的畸变染色体进行分析。不过，染色体涂染探针常不能显示着丝粒及端粒区域。 (1)整条染色体涂染探针 主要用于染色体易位、重排的检测及鉴定标志染色体的来源，但其不能分辨同一染色体臂间易位及染色体倒位。 (2)染色体单臂涂染探针 用于染色体易位（包括臂间易位）、重排的检测及判断标志染色体的来源。 (3)染色体区带涂染探针 可用于检测染色体区带的扩增、缺失、倒位以及染色体间、染色体内的易位。 3．基因探针及其它 单基因探针是针对基因组上的单一核苷酸序列。 （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。 centromere telomere subtelomere locus specific whole chromosome paint 探针的分类 CEP探针：染色体着丝粒探针 GLP探针：位点特异性探针 WCP探针：全染色体或染色体区域特异性探针 根据化学组成，可以将探针分为: DNA探针 RNA探针 PNA：肽核苷酸（PNA）探针 CONTENTS 目录 FISH检测的基本原理 FISH检测的流程 FISH检测的临床应用 间期FISH 中期FISH CONTENTS 目录 FISH检测的基本原理 FISH检测的流程 FISH检测的临床应用 以BCR/ABL为例 正常信号模式为：2G2R（如左图） 典型阳性信号模式为：1G1R2F （如右图） 标记位点：红:ABL(9q34) 绿:BCR(22q11) G代表绿色信号，R代表红色信号，F代表融合信号。 1、肿瘤个体化治疗中的应用（以CML为例） 2、遗传病诊断过程的应用 重复序列或多拷贝的基因家族的染色体定位 杂种亲本染色体的鉴定 染色体的结构分析 异源染色质的鉴定 染色体物理图谱的构建 定位DNA片段及嵌合体克隆验证 确定染色体微小缺失与重复 染色体断裂点分析 间期细胞染色体数目异常诊断 QA 做 最 优 秀 的 第 三 方 检 测 机 构 TO BE THE BEST INDEPENDENT LABORATORIES 临床基因组学教研室 第4章荧光原位杂交技术 原位PCR CONTENTS 目录 FISH检测的基本原理 FISH检测的流程 FISH检测的临床应用 概念 原位杂交( in situ hybridization, ISH )是应用生物化学中核酸分子杂交的原理,在组织切片、细胞涂片或印片上原位检测某种DNA或RNA序列的一项技术。 1969年美国耶鲁大学Gall等首先通过基因探针将核糖体基因在爪蟾卵母细胞上进行定位。 概念