临床分子诊断学：α-地贫琼脂糖凝胶电泳及结果分析.ppt

重型?地贫 ? 出生后1年内发病 ? 多于未成年前因严重贫血而夭折 ? 输血和去铁治疗可维持,代价昂贵 地中海贫血的临床特征 小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度) 黄疸 肝脾肿大 (脾大明显) 骨髓增生 发育迟缓 合并感染 Bart’s 水肿胎 (α地贫,宫内或出生后半小时内死亡) 地中海贫血的血液学表型特征 ? RBC 参数 MCV ? MCH ? 细胞形态变化 ? Hb电泳分析 Hb A2 ? (?) 或 ? (?) Hb Bart’s Hb H (?) Hb E (?) a地贫的基因型与表现型 Normal (αα/αα) 正常 α+ thal trait (αα/-α3.7) (αα/-α4.2) 静止型－单一α基因缺失或丧失功能 临床无任何症状，一般血液学检查无异样，仅平均红细胞体积(MCV) 位于正常值下限。 a地贫的基因型与表现型 Hb H disease (- α 3.7/--SEA) (- α 4.2/--SEA) αo Thal trait (αα /--SEA) ( - α/ - α) 血红蛋白H病－3个α基因缺失或丧失功能 肝脾肿大，中度贫血。小细胞，低色素，HbH含 量较高，易发生溶血，有些病例需不定期输血， 症重者甚至需切除脾脏。 标准型－2个α基因缺失或丧失功能 临床无症状，血液学检查出现轻微贫血，红细胞大小不均一，平均红细胞体积(MCV) 及平均血红蛋白含量(MCH)明显偏低。 a地贫的基因型与表现型 Hb Barts Hydrops (--SEA/--SEA) Hb Bart’s 水肿胎儿综合症 4个?基因缺失或丧失功能 患胎于妊娠晚期或产后数小时内死亡，全身水肿，肝脾肿大。 由于胎儿无法合成?亚基，脐血血红蛋白（ Hb Bart’s ，?4）含量高。 评价 1、本实验的局限性为本方法仅检测3种中国人常见缺失，但不排除其它少见缺失及突变的发生。 2、基因型检测结果虽然是临床诊断的确诊指标，但其临床意义的解释复杂多样，需要结合血液学和临床资料进行综合分析 实验报告（思考题） 写出标本的基因型 若扩增不成功，请列出可能是什么原因导致这种结果 电泳指示剂和染色剂有何区别，各自的作用是什么？ * 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。 相反，在一定浓度的琼脂糖凝胶中，不同大小的DNA片段的迁移率也是不同的。 * * 琼脂糖凝胶分离大分子DNA实验条件的研究结果表明，在低浓度、低电压下，分离效果较好。 随着电压的增高，电泳分辨率反而下降，对于大分子DAN片断。电场强度不宜高于5V/cm。 但对于小片断的DNA可以5-20 V/cm电压电泳 * 吖啶橙（AO）是一种荧光色素，可与核酸亲和的荧光活体染料。荧光显微镜下核呈绿色，细胞质呈黄色。吖啶橙AO常与溴化乙啶EB合用双染. 吖啶橙染液有毒，操作时要戴手套，需避光。 染料存在时，线状DNA电泳迁移率降低约15％ 在凝胶中没有EB时，DNA条带更为清晰，当需要知道DNA片断的准确大小时，可以在无EB情况下电泳，电泳结束后用EB染色 染色方法：将凝胶浸入含有EB(0.5ug/ml)的电泳液中，室温下30-45min。染色完毕后通常不需要脱色。在检测小量DNA(10ng)时，需要脱色，具体方法为将染色后的凝胶浸入水中或1mmol/LMgSO4中，室温脱色20min * 50X储存液，pH8.5：242gTris碱，57.1ml冰醋酸，37.2?g?Na2EDTA.2H2O，加至1L； * 标准型：2个α珠蛋白基因缺失或缺陷，故有相当数量的α链合成，病理生理改变轻微 中间型：α地贫是由3个α珠蛋白基因缺失或缺陷所造成，患者仅能合成少量α链，其多余的β链即合成HbH（β4）。HbH??对氧亲合力较高，又是一种不稳定血红蛋白，容易在红细胞内变性沉淀而形成包涵体，造成红细胞膜僵硬而使红细胞寿命缩短 * 4个α珠蛋白基因均缺失或缺陷，以致完全无α链生成，因而含有α链的HhA、HbA2和HbF的合成均减少。患者在胎儿期即发生大量γ链合成γ4（Hb??Barts）。Hb??Barts对氧的亲合力极高，造成组织缺氧而引起胎儿水肿综合征。。 * 3 指示剂一定要在电泳前加入，指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液；（一般为：溴酚兰，二甲苯青） 作用：①预知电泳的速率及方向；②使样品呈现颜色，便于加样； ③一些高浓度蔗糖或其它物质增加DNA的密度，可以防止DNA的扩散 染色剂即可以在电泳