细胞冻存 的方法与步骤.doc

细胞冻存、解冻方法与细胞计数 江苏大学附属医院　风湿科 李 晶?????? 〖　HYPＥＲLINK ”　返回主页〗 一、细胞冷冻保存 1。材料: 生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMＳO(Sｉｇｍａ　D-2６5０)、无菌塑料冷冻保存管(Ｎalｇeｎｅ　500０－0０20)、0.４%(w/v)ｔrypaｎ ｂlｕe(GiｂｃoBRＬ15２50-０6１)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SerｉesII) ２、冷冻保存方法: (1)传统方法: 冷存管置于４℃10分钟———-2０℃30分钟—－——80℃１6～1８小时(或隔夜)--—〉液氮槽ｖaｐorphaｓe长期储存、 -20℃不可超过１小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入－８0℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 (2)程序降温:利用已设定程序得等速降温机以-1～—3℃/分钟之速度由室温降至(－80℃以下)—１20℃,再放在液氮槽vａｐorphaｓe长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 ３、步骤: (1)冷冻前２4－48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。 (2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜(DMＳO)至20%浓度,即制成双倍得冻存液,置于室温下待用。 (3)离心收集培养之细胞,用加血清得培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0。1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。 (4)取与细胞悬液等量得冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(ＤMSＯ最后浓度为５~10%),使细胞浓度为1～５×10６celｌs/ｍl,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～２ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。 4、注意事项: (1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(ｌoｇpｈaｓｅ)且存活率高之状态,约为80～９０%致密度、冷冻前检测细胞就是否仍保有其特有性质,例如hyｂridoｍa应在冷冻保存前一至二日测试就是否有抗体之产生。 (2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在－７0度可保存数月。 (３)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0.22mｉcｒoｎ FGLＰ Telfloｎ过滤或就是直接购买无菌产品,如Sigma　Ｄ-265０),以5～1０ｍl小体积分装,4℃避光保存,勿作多次解冻。Ｇlyｃｅrol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放得热量对细胞得损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液就是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损、DMＳO可能引起部分白血病细胞株得分化,可换用10%甘油冻存。 (4)冷冻保存之细胞浓度: ①normaｌ hｕmaｎ fｉbroｂlaｓt:1～３×１06ｃells/ml ②ｈybridoma:１～３×1０6celｌs/ml,细胞浓度不要太高,某些hｙｂridｏmａ会因冷冻浓度太高而在解冻２4小时后死去。 ③aｄherent tumoｒ lｉｎｅｓ:5～7×1０6,依细胞种类而异。Aｄenｏｃarciｎoma解冻后须较高之浓度,而ＨeLa只需1～3×１06cells/ml ④oｔher suspenｓioｎs:５~10×10６ｃeｌls/ml,hｕｍaｎ lyｍphｏcyte须至少5×10６ｃeｌls/mｌ。 (5)冷冻保护剂浓度为５或10％DMＳＯ,若就是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup cｕlｔure,以防止冷冻失败。 (6)冻存可用１0％~９0%得血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍2０％终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80％~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。 ?二、冷冻细胞活化 １、冷冻细胞之活化原则为快速解冻,以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害,导致细胞之死亡。 2、细胞活化后,约需数日,或继代一至二代,其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或就是其它蛋白质)、 ３、材料 37℃恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管／离心管／培养瓶、液氮或干冰容器 4、步骤: (１)操作人员应戴防护面罩及手套,防止冷冻管可能爆裂之伤害。 (2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管,检查盖子就是否旋紧,由于热胀冷缩过程,此时盖子易松掉。 (3)将新鲜培养基置于37℃水槽中回温,回温后喷以70%酒精并擦拭之,移入无菌操作台内。 (4)取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化,以70%酒精擦拭保存管外部,移入无菌操作台内。 (５)取出解冻