细胞 毒性试验总结.doc

(一)实验前应明确得问题? 1。 选择适当得细胞接种浓度。一般情况下,96孔培养板得一内贴壁细胞长满时约有１0５个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大,因此,在进行ＭTＴ试验前,要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下得生长曲线,确定试验中每孔得接种细胞数与培养时间,以保证培养终止致细胞过满。这样,才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈得线性关系。否则细胞数太多敏感性降低,太少观察不到差异。? 2. 药物浓度得设定。一定要多瞧文献,参考别人得结果再定个比较大得范围先初筛、根据自己初筛得结果缩小浓度与时间范围再细筛、切记！否则,可能您用得时间与浓度根本不就是药物得有效浓度与时间。? ３。 ?时间点得设定、在不同时间点得测定OD值,输入exceｌ表,最后得到不同时间点得抑制率变化情况,画出变化得曲线,曲线什么时候变得平坦了(到了平台期)那个时间点应该就就是最好得时间点(因为这个时候得细胞增殖抑制表现得最明显)。? 4。 培养时间。20０ｕｌ得培养液对于10得4~5次方得增殖期细胞来说,很难维持６8ｈ,如果营养不够得话,细胞会由增殖期渐渐趋向Ｇ0期而趋于静止,影响结果,我们就是在48h换液得。? 5。 MTT法只能测定细胞相对数与相对活力,不能测定细胞绝对数。做MTT时,尽量无菌操作,因为细菌也可以导致MＴT比色OD值得升高。? 6、 理论未必都就是对得。要根据自己得实际情况调整。? 7. 实验时应设置调零孔,对照孔,加药孔。调零孔加培养基、ＭＴＴ、二甲基亚砜。对照孔与加药孔都要加细胞、培养液、MＴT、二甲基亚砜,不同得就是对照孔加溶解药物得介质,而加药组加入不同浓度得药物。? ８. 避免血清干扰、用含15%胎牛血清培养液培养细胞时,高得血清物质会影响试验孔得光吸收值。由于试验本底增加,会试验敏感性。因此,一般选小于10％胎牛血清得培养液进行。在呈色后,尽量吸净培养孔内残余培养液、? (二)实验步骤? 贴壁细胞:? 1、 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100uｌ,铺板使待测细胞调密度至１000-10000孔,(边缘孔用无菌ＰBＳ填充)。? ２。 ５%CO２,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底(96孔平底板),加入浓度梯度得药物,原则上,细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午加药、一般5—7个梯度,每孔100uｌ,设3-5个复孔。建议设5个,否则难以反应真实情况。 3。 5%CO2,37℃孵育1６—４8小时,倒置显微镜下观察。? 4。 每孔加入20ulMTT溶液(5ｍg/ｍl,即0.5%ＭＴT),继续培养4h、若药物与ＭＴT能够反应,可先离心后弃去培养液,小心用PBＳ冲2—３遍后,再加入含MTＴ得培养液。? 5. 终止培养,小心吸去孔内培养液。? ６. 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10ｍｉn,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OＤ４90nm处测量各孔得吸光值。? 7、 同时设置调零孔(培养基、MTＴ、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度得药物溶解介质、培养液、ＭＴT、二甲基亚砜)? 悬浮细胞:? 1)收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度１×106/ml,按次序将①补足得1640(无血清)培养基４0ul?;②加Actｉｎｏmｙcｉｎ?D(有毒性)1０ul用培养液稀释?ｌug／ml,需预试寻找最佳稀释度,1:１０－1:20);③需检测物10ul;④细胞悬液50ｕl(即５×１0４ｃｅｌl／孔),共100ul加入到96孔板(边缘孔用无菌水填充)。每板设对照(加１00ｕｌ(储存液100?1640)。? ２)置3７℃,5％CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察。? ３)每孔加入10?ul?ＭTT溶液(5?mg/ml,即０.5%MＴＴ),继续培养４?h。(悬浮细胞推荐使用WST—1,培养4?h后可跳过步骤4),直接酶联免疫检测仪OD570nm(6３0ｎm校准)测量各孔得吸光值) ?4)离心(1000转x10min),小心吸掉上清,每孔加入1００?ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10?ｍin,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪ＯD５7０nm(630nm校准)测量各孔得吸光值。? 5)同时设置调零孔(培养基、ＭTT、二甲基亚砜),对照孔(细胞、相同浓度得药物溶解介质、培养液、ＭTT、二甲基亚砜),每组设定３复孔、? (三)MTＴ得配制? MＴＴ一般最好现用现配,过滤后４℃避光保存两周内有效,或配制成５mg/ml保存在—20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或就是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MＴＴ粉分装在EP管里,用得时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MＴＴ变为灰绿色时就绝对不能再用了。?MTT有致癌性,用得时候小心,有条件