细胞损伤 模型.doc

一、体外肝细胞损伤模型建立(CCｌ4与H2O2)?1 大鼠肝细胞得分离与培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉,门静脉插管,先以无钙灌流液灌流,继以3７℃通入Ｏ２得Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min。将肝脏移至一平皿内,轻轻撕去肝包膜后,加入含5％小牛血清得清洗液,用吸管吹打成单个肝细胞悬液,２00目尼龙网过滤,低速离心(５0０　r·miｎ-1,1 mｉｎ,4℃)弃上清,同法用清洗液反复洗3次、然后用完全1640培养液(内含10％小牛血清,10５ U·L－1青霉素,1０0 mg·L—1链霉素与10 mg·L-1胰岛素)制成１×109个·L-１肝细胞悬液、分离得肝细胞经0、6%台盼蓝拒染法测得细胞活力大于９0％,高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定9９％为肝实质细胞。将上述肝细胞悬液分别加入２４孔(每孔１ mｌ)与96孔(每孔０。１　ml)培养板中,置３７℃,5%CO2培养箱中培养。１2～１6 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长、?2 CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立 肝细胞培养12 h后,吸弃上清,更换培养液并加入不同浓度得ＣＣl4〔(1～1６ mｍｏｌ·Ｌ-1),以少量得二甲亚砜助溶,二甲亚砜终浓度为0、1％(体积分数)〕,作用不同时间(1～12　h)后,收集２4孔板中培养上清检测AST,以及肝细胞得MDA含量与ＧSHpｘ活性;同步测定96孔板中培养肝细胞得MTT反应。根据检测结果制备CＣｌ4诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线、选择最造损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设３个复孔、３　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立　同法更换培养液,加入不同浓度得H２O2(０.２～３。2 ｍmol·Ｌ—１),作用不同时间(0、5～4 h)后,收集24孔板中培养上清检测AＬT,测定肝细胞得MDA含量;同步测定９６孔板中培养肝细胞得MTT反应。根据检测结果制备H2Ｏ2诱导肝细胞损伤得量效与时效曲线,选择最适损伤浓度与损伤时间制备肝细胞得损伤模型,同时设溶媒对照组,每组至少设3个复孔。?4　检测指标?(1)? AST、ALT得测定 培养得肝细胞经离心(1 800　ｒ·ｍiｎ-1,1０ mｉｎ)后收集上清,按试剂盒说明书步骤测定上清液中AST与(或)ALT活性,结果以U·(１06　cell)-1表示、(2)? 肝细胞增殖试验　采用MTＴ比色法、??(３)? 肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶(GSHｐx)活性得测定 先制备GSH标准曲线。弃肝细胞培养上清,加入0、２％ Tritｏn－100水溶液0。5 ｍｌ,混匀,２ min后,离心(2　500 ｒ·mｉn-１,1０　ｍin),取上清液(肝细胞样品)0.4 ml,另设样品空白管,非酶反应管与试剂空白管,加入各种试剂。混匀后立即计时,静置１2 min后,以样品空白管调零点,于42３ nm波长处读得吸光度(A)值。在GSH标准曲线上查出对应得ＧＳH波度。GＳHpx酶活力单位就是在3７℃,pH6、５条件下,每106个肝细胞、每分钟使GSＨ浓度下降１ μｍｏｌ为１个酶活力单位。计算公式为:GSHpx活力单位=(［GＳH］非酶管－［GSＨ]样品管－［ＧSH］试剂空白管)/3。结果以Ｕ·(10６ ｃｅlｌ)-1表示。?(4 ) 肝细胞丙二醛(MＤA)含量得测定 先制备MＤA标准曲线。弃肝细胞培养上清,加入生理盐水1 ｍl,混匀,移入离心管中,离心(2 500 r·min－1,10 miｎ),弃上清,加15％ TCA　２ mｌ,破坏细胞并沉淀蛋白质,加入0.６7%　TＢA ２ ml,于沸水浴中加热3０ mｉn。根据样本得吸光度值在标准曲线上查出对应得浓度,结果以 nmol·(１06 ｃelｌ)—1表示。?(5)? 数据处理　数据以±s表示,计量资料组间比较采用t检验。两变量间相互关系,采用直线相关与回归分析。?二、体内肝损伤模型(酒精)?１、材料　纯系SD雄性大鼠,体重180g～２00 g,由浙江大学医学院实验动物中心提供。食用酒精选用北京酿酒总厂出品得56度红星二锅头。?2、方法 将大鼠随机分成5组,饲养在23℃~２５℃室内,自由进食、进水;根据大鼠体重,A、B、Ｃ、D组每日用56°红星二锅头白酒以1０mｌ/1Kｇ分别灌胃 0、４周、8周与12周;E组于酒精灌胃１2周后,停止灌胃4周。大鼠通过股动脉采血处死,收集血浆与肝脏标本、??3、主要指标检测??(１)肝功能:应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白(ＴP)、白蛋白(Alｂ)、球蛋白(Ｇlb)、丙氨酸氨基转移酶(AＬＴ)与天冬氨酸氨基转移酶(ASＴ)等。?(2)氧化抗氧化物质测定:采用南京建成生物工程研究所提供得试剂盒分别检测丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化酶(GSＨ-Ｐx)、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧