第12章免疫组织化学技术.ppt

链霉亲合素(streptavidin，SA)是从链霉菌培养物提取的一种纯蛋白，不含糖基，有4个生物素结合位点，并且具有高度的亲和力，其功能类似亲和素。 利用生物素结合的二抗与酶标记的链霉亲和素蛋白就构成了酶标链霉亲合素-生物素方法(labelled streptavidin biotin technique，LSAB)。 链霉亲合素-生物素法 第四节 免疫标记电镜技术 利用高电子密度的颗粒性标记物（如胶体金、铁蛋白等）标记抗体，或用经免疫组织/细胞化学反应能产生高电子密度产物者如HRP标记抗体，在电子显微镜下对抗原抗体反应中的高电子密度标记的抗原（抗体）进行亚细胞水平定位的技术。 相较于其他免疫组织化学技术是在光镜下进行抗原定位，免疫标记电镜技术在电子显微镜下的定位更为精确，可定位至细胞膜、细胞器，在探索病因、发病机制、组织发生等方面有其独特的优点。 原理 在组织固定与取材时选用固定剂不宜过强，在取材方面，免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、更精细。 在免疫染色方面，又分为包埋前染色、包埋后染色和超薄切片染色三种。 免疫标记电镜技术标本制备要求 免疫胶体金染色法 免疫胶体铁细胞化学染色法 酶免疫电镜技术 常用的免疫标记电镜技术 临床免疫学与免疫学检验 第十二章免疫组织化学技术 免疫组织化学技术（immunohistochemistry technique）又称免疫细胞化学技术，是指用标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项免疫检测方法。 根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为： 酶免疫组织化学技术 荧光免疫组织化学技术 免疫金（银）组织化学技术 亲和组织化学技术 免疫标记电镜组织化学技术 免疫组织化学的基本过程包括： 抗原的提取与纯化 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体以及抗体的纯化 将标记物与抗体结合形成标记抗体 标本的处理与制备 抗原抗体免疫学反应以及标记物呈色反应 观察结果 第一节 酶免疫组织化学技术 定义：在一定条件下，应用酶标抗体（抗原）与组织或细胞标本中的抗原（抗体）发生反应，催化底物产生显色反应，通过显微镜观察标本中抗原（抗体)的分布位置和性质，也可通过图像分析技术达到定量的目的。 标本类型：有组织切片、组织印片和细胞涂片等。 酶免疫组化技术可分为酶标记抗体免疫组化技术和非标记抗体酶免疫组化技术两种类型。 直接法：将酶直接标记在特异性抗体上，与组织细胞内相应的抗原进行特异性反应，形成抗原-抗体-酶复合物，最后用酶底物显色。 间接法：将酶标记在第二抗体上，先将第一抗体（特异性抗体）与相应的组织抗原结合，形成抗原抗体复合物，再用第二抗体（酶标记的抗体）与复合物中的特异性抗体结合，形成抗原-抗体-酶标抗体复合物，最后用底物显色剂显色。 酶标记抗体免疫组织化学染色 直接法 间接法 优点 操作简便 特异性强 检测敏感性高 制备一种酶标二抗可用于检测多种抗原或抗体 缺点 敏感性低 制备的抗体种类有限 特异性不如直接法 操作较为繁琐 酶标记抗体免疫组织化学染色比较 酶桥法：抗酶抗体作为第三抗体，通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与第三抗体连接起来，形成酶联的抗原-抗体复合物，加底物显色（图12-1）。 非标记抗体酶免疫组织化学染色 酶桥法 图12-1 酶免疫组织化学（酶桥法）原理示意图 过氧化物酶抗过氧化物酶（PAP）法：是在酶桥法基础上加以改良。PAP法首先将酶桥法的第三抗体（抗酶抗体）与酶组成可溶性复合物（PAP复合物，图12-2）。该复合物由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成，呈五角形结构，非常稳定。 通过桥抗体（第二抗体），将特异性识别组织抗原的第一抗体与PAP复合物的抗酶抗体连接起来，此时要求特异性第一抗体与第三抗体的动物种属相同（图12-3）。 非标记抗体酶免疫组织化学染色 PAP法 图12-2 PAP复合物 图12-3 酶免疫组织化学（PAP法）原理示意图 双桥PAP法：该法建立在PAP法的基础上。其基本原理是在PAP法中通过两次连接桥抗体和PAP复合物而建立起来的，通过双桥可结合更多的PAP复合物于抗原分子上，以增强敏感性。 碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶（APAAP）法：用碱性磷酸酶代替HRP建立的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)—抗碱性磷酸酶(AAP)法，即简称APAAP。其技术要点与PAP法相似。 非标记抗体酶免疫组织化学染色 酶免疫组织化学染色中的常用酶及显色底物： 酶 底物 颜色 辣根过氧化物酶（HRP） 二氨基联苯胺（DAB） 棕色 氨基乙基卡巴唑（AEC）