生物化学 基因工程 基因工程.pptx

基因工程与常用的分子生物学技术 ;基因工程; 分子生物学技术现已广泛渗透到生命科学和医学等多个学科中，尤其推动了基因工程的发展。 对疾病的发病机制、诊断及药物生产等领域取得了令人瞩目的成就，对医学的发展起着巨大的推动作用。;基因工程(重组DNA技术)指分离目的基因片段，经过剪接后连接到载体上构成重组体，导入宿主细胞后在宿主细胞内进行表达。 核心是DNA片段的重组和细胞克隆;概念;外源核酸分子在宿主细胞中进行复制，跨越了天然物种屏障 少量目的基因片段在???主细胞中实现大量扩增;二、重组DNA技术的基本原理和过程;;（一）目的基因;1．化学合成 ;2. 制备基因组DNA文库 (genomic library) 将基因组DNA酶切成片段，再与载体分子拼接成重组DNA，将其引入宿主细胞进行扩增，所得分子克隆混合体称基因组文库。;;4.聚合酶链式反应(PCR);(二)载体; 质粒是细菌或细胞质中，独立于染色质的共价闭环小分子双链DNA，能自主复制，与细菌或细胞共生。; 缺点：;(2)噬菌体(bacteriophage，phage);?噬菌体感染大肠杆菌的途径;Lambda （λ）噬菌体载体;λ噬菌体载体对外源基因的容量更大，可以插入的片段大小可以达到20几kb。 由于是体外包装成噬菌体颗粒再感染宿主细胞，较之于质粒DNA的直接转化，效率更高。 λ噬菌体载体宿主的选择面较窄，在操作的安全性上比质粒DNA有优势。 ;(3)粘粒(cosmid); ;克隆载体：具有复制起点，标志基因等。 表达载体：除具有克隆载体的特点外， 还带有表达构件转录和翻译 所必需的DNA序列。;限制性核酸内切酶是一类能识别并切割双链DNA分子内部特异序列的酶。 限制性内切酶识别的DNA序列具有回文结构特征。; 不同的限制性内切酶识别和切割的特异性不同，结果有3种不同的情况：;; DNA连接酶（DNA ligase）;(四)目的基因与载体的连接——重组体的构建;1. 粘末端连接;(五)将重组DNA导入宿主细胞;1. 转化（transformation）;1.遗传学方法 针对载体携带有某些标志基因如抗药性标志基因(ampr、tetr 、kanr等)和目的基因而设计的筛选方法。 2.分子杂交方法 利用32P标记的探针与重组DNA或克隆DNA片段进行分子杂交，直接筛选并鉴定目的基因。 3.免疫学方法 利用特异性抗体与目的基因表达产物特异结合的方法筛选。;遗传学方法; ;遗传学方法; α 互补的检测 ; ;(七)目的基因的表达;三、重组DNA技术在医学中的应用;（二）疾病的发现和诊疗;