杂交瘤技术PPT演示课件.ppt

杂交瘤技术（hybridoma technique）;内容纲要;;一、细胞融合（cell fusion） ;;2、诱导细胞融合的常用方法;（1）仙台病毒融合法;;（2）聚乙二醇融合法;;（3）电融合法;;3、杂种细胞的筛选;HAT是最常用的筛选系统;主要合成途径; 细胞可通过次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 （HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK），将核苷酸前体合成核苷酸以供DNA合成的原料。;DNA的生物合成途径与HAT选择培养基;凡能在HAT选择培养基中生长的细胞，必须能利用外源性次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）； HGPRTˉ或TKˉ细胞在HAT培养基上不能存活； HGPRTˉ与TKˉ细胞融合或与正常细胞融合后的杂交细胞，可在HAT培养基上存活。; 可人为地筛选或致突变，诱发一些细胞缺乏HGPRT或缺乏TK，如用毒性药物8-氮鸟嘌呤（8-azaguanine，8-AG)作用于细胞株，可选育出HGPRTˉ细胞株，这是因为HGPRT+细胞利用了8-AG后，因合成毒性核苷酸而死亡??;;二、杂交瘤技术与单克隆抗体的制备;杂交瘤技术（也称单克隆抗体制备技术） 是指建立杂交瘤细胞系的技术，通常指B淋巴细胞杂交瘤技术，即将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立可以分泌单一性抗体的杂交瘤细胞系的技术。;单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 指由一个B淋巴细胞克隆所产生的，只识别一种抗原决定簇的均质抗体。 克隆 指通过一定方法获得由单个细胞无性繁殖形成的细胞集落。; ;（二）杂交瘤技术产生的三个技术关键;;脾细胞 (B淋巴细胞);脾细胞 (B淋巴细胞);HAT培养基筛选;（三）单克隆抗体的制备过程;三个基本环节和两个决定因素;1、免疫小鼠和脾细胞的制备;;3、饲养细胞的准备;常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。其中小鼠腹腔巨噬细胞使用最为普遍，因其来源及制备较为方便，且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用。 饲养细胞的制备： 细胞融合前一天，从同系正常小鼠腹腔取巨噬细胞，加入培养板，96孔板每孔细胞数为2×104；24孔板，每孔为1×105个，置37℃培养。;4、 50%PEG配制;5、细胞融合;（4）慢慢加入预热的无血清1640 1ml ，1min，目的是稀释PEG；再加入1ml，1min。最后加入7ml ，2-3min内加完，并持续轻轻搅动，此时细胞对机械损伤非常敏感。 （5）离心1000rpm，室温10 min，去上清。 （6）取预热的15%牛血清1640，先加10ml，对准细胞团加液，使细胞颗粒均匀分布于悬液中；再加入90ml。 （7）加入已含有饲养细胞的96孔板或24孔板（每孔加入细胞数分别为2×105 和1×106 ）。;6、HAT 和HT选择培养;7、抗体的筛查;8、克隆化;有限稀释法（较常用）：使96孔板上其中36孔每孔5个细胞，另36孔每孔1个细胞，余下24孔每孔0.5个细胞；亦有经连续稀释成最终30个/ml，每孔0.1ml接种48孔。 软琼脂平板法 FACS选取法 显微挑选法;克隆化培养后，通常在10~14天测抗体进行阳性克隆的筛查。 取抗体阳性的克隆，可继续克隆化或进一步扩大培养。 阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防染色体丢失、变异及污染。;9、抗体大量生产;10、杂交瘤细胞的保存;11、细胞复苏;12、杂交瘤抗体的贮存